鹿血多肽的制備工藝及抗氧化能力研究

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(1.吉林省中韓動物科學研究院,吉林長春 130600；2.吉林農業大學中藥材學院,吉林長春 130118；3.長春中醫藥大學附屬醫院,吉林長春 130021；4.長春科技學院,吉林長春 130600)

鹿血多肽的制備工藝及抗氧化能力研究

胡太超1,2,陶榮珊1,李慶杰3,張晶1,4,蘇鳳艷1,王艷梅1,4,王全凱1,2,*

(1.吉林省中韓動物科學研究院,吉林長春 130600；2.吉林農業大學中藥材學院,吉林長春 130118；3.長春中醫藥大學附屬醫院,吉林長春 130021；4.長春科技學院,吉林長春 130600)

以新鮮鹿血為原料,利用胰蛋白酶水解制備鹿血多肽,以水解度為指標,在單因素和正交實驗的基礎上,確定酶解的最佳工藝條件,即加酶量為6%,pH為9,反應溫度為37℃,反應時間為4h,水解度為46.72%±0.11%。并進一步對鹿血多肽進行抗氧化能力測定,在高濃度時多肽的羥自由基清除能力和DPPH自由基清除能力較高。

酶解,正交實驗,抗氧化能力

鹿血即梅花鹿或馬鹿的膛血或茸血,系傳統的名貴中藥。其性熱,味甘咸,歸肝、腎二經；具有養血益精、行血祛瘀、消腫療傷等作用[1]。經近代動物實驗和臨床研究表明,鹿血具有抗缺氧抗疲勞[2]、抗衰老[3]、增強免疫功能[4]、補腎益精[5]、促進代謝[6]、補血功能[7]、對神經功能的影響[7]和創傷愈合[8]等方面的藥理作用,具有很好的藥用價值和巨大的開發潛力。

鮮鹿血含水分80%～81%,有機成分16%～17%,其中主要是蛋白質[9]、酶類[10]、多種脂類、磷脂、嘌呤、激素類、固醇類、維生素類、糖脂類和多糖類等；無機成分占2%～4%,灰分占3%～4%,并含多種常量和有益微量元素[11]。

鹿血的研究和應用仍處在初級階段,大多為粗制品,沒有進行深加工,對鹿血加工利用和功能作用的研究比較滯后。目前鹿血產品主要形式為鹿血酒、鹿血口服液、鹿血口嚼片、鹿血滋補膠囊。本文利用胰蛋白酶對鹿血進行水解,制備鹿血多肽,通過正交實驗探索最佳提取工藝條件,為鹿血的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮鹿血 購于雙陽鹿鄉；胰蛋白酶(活力250U/mg) 上?；菔郎锟萍加邢薰?；鄰苯三酚,水楊酸,FeSO4,H2O2長春賽奧克生物科技有限公司；DPPH Sigma公司；其它試劑均為分析純。

PHS-3C精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；GB204電子分析天平 德國SARTORIUS公司；W201B恒溫水浴鍋 上海申生科技有限公司；UV2800紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2實驗方法

1.2.1 水解度的測定 取一定量新鮮鹿血,按1∶9的體積比加入5%檸檬酸鈉,然后4000r/min離心30min,取上清液進行酶解,并計算出其水解度。選取加酶量、pH、反應時間、反應溫度四個因素,研究其對鹿血水解度的影響,找出最優酶解條件。

本實驗采用pH-state法[12]測定水解度,計算公式如下:

DH(%)=B×N×1/α×1/m×1/htot×100

其中:B是堿液的體積(mL)；N是堿液的摩爾濃度(mol/mL)；α是氨基的解離度；m是底物中蛋白質的質量(g)；htot是每克原料蛋白的肽鍵毫摩爾數(mmol/g)。

1.2.2 單因素實驗設計

1.2.2.1 加酶量對水解度的影響 取等體積鹿血5份,調節pH為8.5,分別加入2%、3%、4%、5%、6%的胰蛋白酶于37℃反應4h,測定其水解度,重復3次,取平均值。

1.2.2.2 不同pH對水解度的影響 取等體積鹿血5份,加入5%的胰蛋白酶,分別調節pH為7、7.5、8、8.5、9,于37℃反應4h,測定其水解度,重復3次,取平均值。

1.2.2.3 酶解時間對水解度的影響 取等體積鹿血5份,加入5%的胰蛋白酶,調節pH為8.5,置于37℃水浴中,分別反應2、4、6、8h,測定其水解度,重復3次,取平均值。

1.2.2.4 反應溫度對水解度的影響 取等體積鹿血5份,加入5%的胰蛋白酶,調節pH為8.5,調節反應溫度分別為30、34、37、40℃,反應4h,測定其水解度,重復3次,取平均值。

1.2.3 正交實驗設計 在單因素實驗的基礎上采用正交實驗對酶解工藝進行優化,按L9(34)正交表進行正交實驗。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.2.4 抗氧化能力測定 本文采用體外抗氧化模型對最佳工藝條件下制備的鹿血多肽進行抗氧化能力測定,水解度為46.72%。在0.1～10mg/mL范圍內與維生素C(VC)的抗氧化能力進行對比,初步研究了其抗氧化能力。

1.2.4.1 羥自由基清除能力的測定 采用水楊酸比色法測定多肽對羥自由基清除能力。具體測定參照文獻[13]:在干燥的試管中分別加入2.0mmol/L硫酸亞鐵溶液1.5mL、30mmol/L過氧化氫溶液1.5mL、6.0mmol/L水楊酸溶液1.5mL,振蕩,搖勻,于37℃水浴,15min后取出,在510nm處測其吸光度A0；然后加入樣液2.0mL,振蕩,搖勻,于37℃水浴15min后取出,測其吸光度A。重復測定三次,取平均值。

清除率計算公式為:

清除率(%)=(A0-A)/A0×100

式中:A0-為試劑空白液的吸光度；A-為樣液的吸光度。

1.2.4.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[14]測定鹿茸多肽對超氧陰離子自由基的清除能力。具體測定參照文獻[15]:在干燥的試管中加入4.5mL 0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH8.2),4.0mL去離子水,0.2mL待測樣液,混勻后,置于25℃恒溫水浴10min。取出后迅速加入0.3mL(25℃溫浴10min)的鄰苯三酚溶液(3mmol/L,10mmol/L HCl配制),混勻后立即在320nm下測定,每隔30s測定1次吸光度值,記錄4min內吸光度值的變化,并求出其變化斜率,用10mmol/L HCl代替鄰苯三酚做空白調零。用去離子水代替樣品溶液同樣方法測定4min內吸光度值的變化,并求出其變化斜率。重復實驗三次,取平均值。

清除率計算公式為:

清除率(%)=(k0-k)/k×100

式中:k0-空白管吸光度值變化斜率；k-樣品管吸光度值變化斜率。

1.2.4.3 DPPH自由基清除能力的測定 參照文獻[16]的DPPH測定方法:無水乙醇配制DPPH溶液0.2mmol/L,保存于棕色瓶中備用。精確吸取2mL不同濃度的樣品于試管中,分別加入2mL DPPH溶液,充分混合、搖勻,水浴(40℃)30min后倒入比色皿中,于517nm處測定其吸光度值A1,同樣測定2mL樣品液和2mL無水乙醇的吸光度值A2以及2mL DPPH溶液加入2mL蒸餾水的吸光度值A0。用蒸餾水作空白。重復3次,取平均值。樣品溶液對DPPH自由基清除率(即抑制率)用下面的公式計算:

P(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

《魯迅小說》頻率最高的前10字：“的、了、一、是、不、他、我、有、在、來”占《魯迅小說》全部語料的18.68%；前100字占53.4045%?！侗闭Z字表》頻率最高的前10字“的、一、他、我、是、了、不、在、這、人”占全部語料的17.46%；前100字占48.92%。

式中:P-抗氧化劑對DPPH自由基清除率(%)；A1-2.0mL樣品液+2.0mLDPPH溶液混合液的吸光度值；A2-2.0mL樣品液+2.0mL無水乙醇混合液的吸光度值；A0-2.0mLDPPH溶液+2.0mL蒸餾水混合液的吸光度值。

2 結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1 加酶量對水解度的影響 結果見圖1,在一定范圍內加酶量對水解度影響較大,隨著加酶量的增加,水解度增大,當加酶量達5%后,水解度增加幅度趨于平緩,此時加酶量對水解度影響不大,酶與底物結合達到飽和狀態,所以從實驗成本和水解效率兩方面考慮,最適加酶量確定為5%。

圖1 加酶量對水解度的影響Fig.1 Effects of enzyme content on the DH

2.1.2 不同pH對水解度的影響 結果見圖2,pH在7～9時,水解度隨pH增大而增大,在pH為9.5時酶已失活,所以酶的最佳pH為9。

圖2 不同pH對水解度的影響Fig.Effects of different pH on the DH

2.1.3 酶解時間對水解度的影響 結果見圖3,在前6h內,水解度隨時間延長而增大,4～6h增長較快,6h后增長緩慢,趨于平緩,因此選用6h為最適酶解時間。

圖3 酶解時間對水解度的影響Fig.3 Effects of enzymolysis time on the DH

2.1.4 反應溫度對水解度的影響 結果見圖4,反應溫度不同會影響酶活力的大小,從而影響水解度的大小。在一定范圍內,隨著反應溫度的升高,水解度增大,達到37℃后,水解度開始下降,所以本實驗的最佳反應溫度為37℃。

圖4 反應溫度對水解度的影響Fig.4 Effects of reaction temperature on the DH

2.2正交實驗

由極差分析可知四個因素對水解度影響的主次順序是加酶量>pH>反應溫度>反應時間,方差分析表明,加酶量、pH和反應溫度對結果均有極顯著影響,反應時間有顯著影響。提取鹿血多肽的最優工藝條件為A3B3C1D2,即加酶量為6%,pH為9,反應溫度為37℃,反應時間為4h。

經實驗驗證,實驗條件:加酶量為6%,pH為9,反應溫度為37℃,反應時間為4h,平行測定三次,水解度以均值±標準偏差的形式表示為46.72%±0.11%。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of the orthogonal test

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

注:F0.01(2,9)=8.02；F0.05(2,9)=4.26。

2.3抗氧化能力測定

2.3.1 羥自由基清除能力的測定 由圖可以看出0.1～4mg/mL范圍內,VC的羥自由基清除能力隨著其濃度的增加而增加,4mg/mL后清除能力增加緩慢,趨于飽和。多肽的清除能力隨著濃度的增加而增加,當4mg/mL,增加緩慢。2mg/mL后多肽的清除能力強于VC,表現出較強的羥自由基清除能力。

圖5 羥自由基清除能力Fig.5 Hydroxyl radcals scavenging ability

2.3.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定 VC的清除率開始時增加較明顯,1mg/mL后增加趨于平緩,但始終高于多肽的清除率。多肽隨著濃度增加,超氧陰離子自由基清除率增加,但增加較緩慢。多肽的超氧陰離子清除能力較弱。的清除率開始時增加較明顯,1mg/mL后增加趨于平緩,但始終高于多肽的清除率。多肽隨著濃度增加,超氧陰離子自由基清除率增加,但增加較緩慢。多肽的超氧陰離子清除能力較弱。

圖6 超氧陰離子自由基清除能力Fig.6 Superoxide anion radical scavenging ability

2.3.3 DPPH自由基清除能力的測定 VC的DPPH自由基清除能力變化不明顯,0.1～10mg/mL間均在90%左右波動。多肽的清除能力隨著濃度增加而增大,10mg/mL時接近VC的清除能力。說明多肽低濃度時,清除率低于VC的清除率,高濃度時其清除能力與VC相當。

的DPPH自由基清除能力變化不明顯,0.1～10mg/mL間均在90%左右波動。多肽的清除能力隨著濃度增加而增大,10mg/mL時接近VC的清除能力。說明多肽低濃度時,清除率低于VC的清除率,高濃度時其清除能力與VC相當。

圖7 DPPH清除能力Fig.7 DPPH radical scavenging ability

3 結論

通過正交實驗研究對水解度影響的主次順序依次是加酶量、pH、反應溫度、反應時間,最佳提取工藝條件:加酶量為6%,pH為9,反應溫度為37℃,反應時間為4h。經過驗證,在此條件下的水解度為46.72%,表明此方法可行。通過與VC的抗氧化能力

對比,鹿血多肽在高濃度時的羥自由基清除能力和DPPH自由基清除能力較高,可能與鹿血中所含的抗氧化活性肽有關。本實驗研究為鹿血的進一步開發利用提供基礎依據。

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Study on the preparation process and the antioxidant capacity of deer blood polypeptide

HUTai-chao1,2,TAORong-shan1,LIQing-jie3,ZHANGJing1,4,SUFeng-yan1,WANGYan-mei1,4,WANGQuan-kai1,2,*

(1.Jilin Sino-ROK Academy of Animal Sciences,Changchun 130600,China;2. College of Chinese Medicinal Materials,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;3. The Affiliated Hospital of Changchun College of TCM,Changchun 130021,China;4. Changchun University of Sciences and Technology,Changchun 130600,China)

The extraction of deer blood polypeptide was studied using trypsin hydrolysis with resh deer blood as aw material. This article took the degree of hydrolysis as index. The optimum conditions for enzymatic hydrolysis was determined on the basis of single factor and orthogonal experiment. The optimum conditions were the amount of enzyme 6%,pH9,the hydrolysis temperature 37℃,reaction time 4h,which the degree of hydrolysis reached 46.72%±0.11% under this condition. And determination of antioxidant capacity of the peptides were performed. The high concentration of deer blood polypeptide had strong hydroxyl radicals scavenging ability and DPPH radical scavenging ability.

enzymatic hydrolysis;orthogonal experiment;antioxidant capacity

2013-11-28 *通訊聯系人

胡太超(1989-),女,碩士,研究方向:動物藥。

國際科技合作專項(2011DFA32900)；吉林省科技發展計劃項目(20120246)；長科技合(2012219)。

TS

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001