白芍多糖提取工藝優化、分子特性分析及其對巨噬細胞的增殖作用

曹榮安，張承泰，季瑞雪，張佳苗，賈 建，牛廣財，王長遠，李興革,

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶163319；2.黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，黑龍江大慶163319）

白芍（Radix Paeoniae Alba）是毛茛科植物芍藥的干燥根，其斂陰收汗、養血調經、柔肝止痛的功效在《傷寒論》等藥學著作中均有記載[1]，此外，白芍還具有抗炎、抗抑郁及神經保護等功能[2?4]。白芍作為中醫臨床中的常見藥物，伴隨著科學和技術的發展，關于其有效成分的研究日益增多。白芍多糖是白芍中重要的活性成分之一，考慮到價格、毒害及操作安全性等方面，白芍多糖現行的提取工藝仍以傳統的水提醇沉法為主，所以，此提取工藝的進一步優化是十分有必要的。而多糖作為一種廣泛存在于動植物體及微生物中的高分子碳水化合物，能夠參加生命體中的各項細胞活動。現代醫學研究表明，多糖普遍具有抗炎、抗癌、抗腫瘤、抗氧化和降血糖等藥理作用[4?7]。目前已有部分多糖被應用于臨床醫學當中，如香菇多糖已被應用于肺癌的輔助治療及抗腫瘤治療當中，黃芪多糖也已被應用于抗腫瘤治療[8?10]。

目前，關于白芍多糖生物活性的現有文獻報道大多集中在美白、抗氧化、抗抑郁等活性方面[11?13]，為了未來能夠將白芍多糖成功應用于保健食品及臨床醫藥當中，其分子特性、免疫活性和抗癌活性等還需要進一步的研究。因此，本文對白芍多糖的分子特性和激活巨噬細胞能力進行研究，以期為白芍多糖后續的深入開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白芍 購自大慶福瑞邦藥房連鎖有限公司，產地為四川省峨眉山；蛋白質定量試劑盒 美國Bio-Rad公司；WST-1試劑盒 碧云天生物制劑研究所；單糖標準品、牛血清蛋白、葡萄糖醛酸 美國Sigma-Aldrich公司；RAW264.7細胞 美國模式培養物集存庫（ATCC）；無水乙醇、丙酮 遼寧泉瑞股份有限公司，分析純。

3802UV/VZS分光光度計 美國Unico公司；TSK Gel色譜柱 日本Tosoh公司；2487紫外檢測器、2414示差折光檢測器 美國Waters公司；DAWN HELEOS多角度激光光散射檢測器 美國Wyatt公司；6890N/MSD5973氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀

美國Agilent公司；Excella ECO-170細胞培養箱

英國New Brunswick Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白芍多糖的提取工藝 采用水提醇沉法提取白芍多糖：挑選除雜的白芍原料烘干粉碎，70 ℃下用85%乙醇回流攪拌2 h，冷卻至室溫后繼續攪拌12 h，離心去上清液，殘渣分別加入85%乙醇和無水丙酮攪拌，使用3000 r/min的轉速離心5 min后，取沉淀自然干燥，得脫脂白芍原料。用蒸餾水對脫脂白芍原料進行加熱回流攪拌兩次，合并上清液并濃縮后加入無水乙醇，使最終溶液的乙醇體積分數為80%，4 ℃靜置12 h。離心（3000 r/min, 5 min）后收集沉淀，用無水乙醇和丙酮洗滌沉淀，自然干燥得白芍多糖。稱重后按照公式計算白芍多糖得率，計算公式：多糖得率（%）=（提取得到的白芍多糖質量/脫脂原料質量）×100。

1.2.2 白芍多糖的提取參數優化 本研究以白芍多糖得率為指標，分析液料比、提取溫度和提取時間三個因素對白芍多糖得率的影響，對應的各因素水平參數 如 下：液 料 比 為10:1、15:1、20:1、25:1、30:1（mL/g）時，對應的提取溫度和提取時間分別為80 ℃和2 h。提取溫度為75、80、85、90、95 ℃時，對應的液料比和提取時間分別為10:1 mL/g和2 h。提取時間為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h時，對應的液料比和提取溫度分別為10:1 mL/g和80 ℃。根據單因素結果進行正交試驗，從而確定白芍多糖的最佳提取工藝參數。

1.2.3 白芍多糖的化學成分分析 分析白芍多糖的化學組成，采用苯酚-硫酸法[14]測定總糖含量，福林-酚法[15]測定蛋白質含量，氯化鋇-明膠渾濁法[16]測定硫酸根含量，間羥基聯苯法[17]測定糖醛酸含量。

1.2.4 白芍多糖的相對分子質量測定 將白芍多糖水溶液膜過濾后注入高效尺寸排阻色譜-紫外檢測器-多角度激光光散射儀-示差折光檢測器聯機系統（HPSEC-UV-MALLS-RI），并設置測定參數如下：采用添加了0.02%NaN3、濃度為0.15 mol/L的NaNO3溶液作為流動相，流速為0.4 mL/min，UV的檢測波長設定為280 nm，檢測結果采用ASTRA 6.1軟件進行結果分析[15]，計算公式為：

其中，N為阿伏伽德羅數（6.02×1023/mol），旋轉比體積（SVg）、重均分子量（Mw）、回轉半徑（Rg）的單位分別為cm3/g、g/mol、nm。

1.2.5 白芍多糖的單糖組成和鏈接方式分析 采用作者適當改動后的Ciucanu等[18]的方法，對白芍多糖進行相應衍生化處理后，通過GC-MS檢測得到單糖[15]及其鏈接方式[19]的相應氣譜出峰時間和質譜離子峰，將其與單糖標準品和不同鏈接方式的多糖分別進行比較分析，得到白芍多糖的單糖組成和鏈接方式。

1.2.6 白芍多糖對巨噬細胞增殖率的影響 本研究采用WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒測定白芍多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖的影響。向96孔平板中加入細胞濃度為1×106cells/mL的RAW264.7細胞，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h。棄去上清液，空白組添加培養液，試驗組中分別加入2、5、10 μg/mL的白芍多糖溶液，繼續培養24 h。棄去上清液，每孔加入體積分數10% WST-1溶液后再培養1 h，用酶標儀測定吸光度（450 nm），公式計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）=（試驗組的吸光度值/空白組的吸光度值）×100。

1.3 數據分析

以上實驗重復三次，數據采用M±SD表示，使用Sigmaplot 12.0作圖。應用SAS 8.2軟件對數據進行統計分析，各實驗組之間的顯著性差異分析采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和鄧肯氏復極差法。

2 結果與分析

2.1 白芍多糖提取工藝優化

2.1.1 單因素實驗結果 液料比、提取溫度和提取時間是白芍多糖得率的重要影響因素，各項單因素實驗結果見圖1。在液料比單因素實驗中，白芍多糖得率隨液料比的增加呈現先升高后降低的趨勢，當液料比為25:1 mL/g時多糖得率達到最大值（10.18%），當液料比為30:1 mL/g時，白芍多糖得率大幅減少。分析其原因在于，適當增大浸提溶劑體積可以促進多糖的溶出，但過量的溶劑存在則會影響整個體系的傳熱和傳質，導致多糖得率降低[20]。而在提取溫度單因素實驗中，80～85 ℃區間范圍內的白芍多糖得率升高，85 ℃時多糖得率達到峰值，可能是由于高溫使多糖中的部分糖苷鍵被破壞，使得多糖發生降解，從而造成白芍多糖得率減少。隨著提取時間的增加白芍多糖得率呈現出先增加后降低的趨勢，提取時間3.0 h時白芍多糖得率最高，為9.86%。因此，最終選定用于正交試驗的各因素水平分別為：液料比20:1、25:1、30:1（mL/g），提取溫度80、85、90 ℃，提取時間2.5、3.0、3.5 h。

圖1 不同因素水平對白芍多糖得率的影響Fig.1 Effect of different factors on the extraction rate of the polysaccharides from Radix Paeoniae Alba

2.1.2 正交試驗結果 根據單因素結果確定的液料比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）水平，進行正交試驗，正交試驗安排和結果見表1。以多糖得率為指標，直觀分析各因素對多糖得率的影響順序為：B＞A＞C，最佳工藝參數為A2B2C2，即液料比為25:1 mL/g，提取溫度85 ℃，提取時間3.0 h，經驗證此時白芍多糖的得率為12.40%±0.04%。實驗得到的白芍多糖最高提取率的值與麥韻炫[21]的實驗結果相近（12.65%），該實驗雖然也是使用水提醇沉法對白芍多糖進行提取，但是其獲得最高得率時的提取工藝在液料比為15:1 （V/V）的情況下沸水浸提2 h，重復提取三次并收集藥渣潤洗液，這與本方法有所不同，而且多糖得率也同原料來源和前處理方式有關。

表1 正交試驗安排和結果Table 1 The plan and results of the orthogonal experiment

2.2 白芍多糖的化學成分和單糖組成

白芍多糖的化學成分組成結果見表2。白芍多糖主要由96.2%±1.2%總糖和5.5%±0.6%蛋白質組成，未檢出硫酸根和糖醛酸，有文獻報道白芍多糖中含有糖醛酸（3.3%）[22]。糖醛酸檢測結果出現差別的原因可能有兩方面，首先是白芍多糖的提取方法存在明顯差異，其次可能與原料產地不同有關。

采用GC-MS對白芍多糖的單糖組成進行分析，結果見表2。發現白芍多糖中主要的單糖為葡萄糖（96.8%±0.8%），還含有少量的阿拉伯糖（2.4%±0.1%），而半乳糖、鼠李糖、木糖和甘露糖的含量較低。汪蕓等報道稱白芍多糖由六種單糖（葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖）組成，其中主要的單糖為葡萄糖[22]。相似的是，在秦亞東等人對白芍多糖單糖組成的研究中，提取得到的幾種白芍多糖中葡萄糖的摩爾比均超過92.0%，同時還含有少量的鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖[23]。雖然單糖組成分析結果在各種單糖的含量上存在著細微區別，但是從白芍多糖的單糖組成成分和單糖比例角度分析，這些報道的結果與本文檢測結果是一致的。

表2 白芍多糖的化學成分和單糖組成Table 2 Chemical and monosaccharide compositions of the polysaccharide from Radix Paeoniae Alba

2.3 白芍多糖的相對分子質量

白芍多糖的示差折光檢測曲線和紫外色譜圖見圖2。白芍多糖在RI檢測曲線上出現了一個單一吸收峰，同時在UV檢測曲線上也存在一個明顯的蛋白吸收峰，證明白芍多糖樣品中含有一定含量的蛋白質，這與前面化學組成分析是相一致的。相對分子質量及支化度不僅是鑒定多糖結構時的重要數據支撐，還是影響多糖生物活性的兩個重要因素。利用ASTRA 6.1軟件進行分析計算后得到白芍多糖的分子質量（Mw）為2.3×106u和回轉半徑（Rg）為234.9 nm。

圖2 白芍多糖示差折光檢測曲線和紫外色譜圖Fig.2 RI and UV chromatograms of the polysaccharide from Radix Paeoniae Alba

2.4 白芍多糖的鏈接方式

白芍多糖經衍生化處理后得到的部分甲基化糖醇乙酸酯衍生物的總離子流色譜圖和三個主峰質譜圖見圖3，檢測得到的6個碎片離子峰的質譜圖與標準質譜NIST庫比對分析結果見表3。相對峰面積最大的殘基（峰2）對應的是2,3,6-tri-O-甲基吡喃葡萄糖醇乙酸酯（87.0%±2.5%），峰1對應的是2,3,4,6-tetra-O-甲基吡喃葡萄糖醇乙酸酯（6.8%±0.8%），峰6對應的是2-mono-O-甲基吡喃阿拉伯糖醇乙酸（3.7%±0.6%），由此說明白芍多糖是以（1→4）葡萄糖為主鏈。在甲基化分析結果中，除葡萄糖外只檢測到了少量的阿拉伯糖以（1→3,4）阿拉伯糖連接方式存在。

圖3 白芍多糖部分甲基化糖醇乙酸酯衍生物的總離子流色譜圖和質譜圖Fig.3 Total ion current chromatograms and mass spectra of partially methylated alditol acetates derivatives of the polysaccharides from Radix Paeoniae Alba

表3 白芍多糖的甲基化分析結果Table 3 Methylation analysis of the polysaccharide from Radix Paeoniae Alba

2.5 白芍多糖對巨噬細胞增殖率的影響

白芍多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖活性的影響見圖4。隨著白芍多糖濃度增加，巨噬細胞的增殖率呈上升趨勢，而且具有一定的濃度依賴性。白芍多糖濃度2 μg/mL與5 μg/mL處理導致的巨噬細胞增殖率無顯著差異（P＞0.05），白芍多糖濃度為10 μg/mL時的細胞增殖率與兩個低濃度處理的細胞增殖率存在顯著性差異（P＜0.05），結果表明白芍多糖在一定濃度范圍內能夠促進巨噬細胞增殖。由于多糖普遍對巨噬細胞有免疫調節作用，結合現有數據可知，白芍多糖存在潛在的免疫調節能力，因此有必要開展對白芍多糖免疫活性的研究。有研究發現白芍多糖具有抗糖尿病的作用，并且其能夠有效抑制路易斯肺癌細胞和S180細胞瘤的生長[24?25]。目前，眾多研究表明，調控糖尿病和癌細胞凋亡的信號通路都與免疫系統和免疫因子有著密不可分的關系，已發表的文獻中白芍多糖對糖尿病和癌細胞發揮作用的調控機制是否與其可以促進免疫細胞增殖有關十分值得探究。因此，本論文有望為后續有關于白芍多糖發揮其生物活性的作用機制以及分子結構對其生物活性的影響的研究奠定理論基礎。

圖4 白芍多糖對小鼠巨噬細胞增殖的影響Fig.4 Effect of the polysaccharides from Radix Paeoniae Alba on the proliferation of RAW264.7 cells

3 結論

研究發現，在液料比為25:1 mL/g、提取溫度為85 ℃、提取時間為3.0 h的提取條件下時，白芍多糖的提取率最高，達12.40%。提取得到的白芍多糖是一種糖含量高達96.2%的中性均一多糖，含有少量的蛋白質。其主要的單糖組成成分為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。體外細胞實驗證明，白芍多糖能夠有效地促進小鼠巨噬細胞RAW264.7的增殖。因此，該結果可以為白芍多糖作為一種新型的天然免疫調節劑應用于食品和醫藥行業提供技術支持和理論依據。