重組人甲狀旁腺素1-34對去卵巢大鼠骨質疏松的作用研究

陳波 李翠瓊 朱常青 李婉媚 曹小禎

[摘要] 目的 探討重組人甲狀旁腺素1-34（hPTH1-34）對去卵巢大鼠骨質疏松的治療作用。 方法50只7個月齡SD健康雌性大鼠，30只行雙側卵巢摘除術，20只做假手術（SHAM），12周后各處死10只證實骨質疏松造模成功。余20只雙側卵巢摘除大鼠隨機分為去卵巢（OVX）安慰劑組10只和hPTH1-34治療組10只，10只SHAM組作對照。hPTH1-34治療組劑量為20 μg/kg，皮下注射，每周注射3次。OVX安慰劑和SHAM組皮下注射0.5 mL生理鹽水，每周注射3次。治療3個月后，測定并比較三組股骨、腰椎骨密度（BMD）、血清鈣、磷、骨源性堿性磷酸酶（BALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（Trap-5b）水平。 結果 hPTH1-34治療組股骨和腰椎BMD較OVX安慰劑組明顯升高[（0.151±0.008）g/cm2比（0.135±0.013）g/cm2，（0.181±0.010）g/cm2比（0.159±0.008）g/cm2，P < 0.01]，血清鈣、磷、BALP、Trap-5b水平明顯高于OVX安慰劑組（P < 0.05或P < 0.01），與SHAM組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 hPTH1-34通過刺激成骨細胞的活性，抑制破骨細胞，可顯著增加BMD，對去卵巢大鼠骨質疏松有效。

[關鍵詞] 重組人甲狀旁腺素1-34；骨質疏松癥；骨密度；骨轉換指標

[中圖分類號] R580[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-7210（2014）06（b）-0017-04

Effect of human parathyroid hormone (hPTHl-34) on osteoporosis of ovariectomized rats

CHEN Bo1 LI Cuiqiong1 ZHU Changqing1 LI Wanmei1 CAO Xiaozhen2

1.Department of Endocrinology, the 12th People′s Hospital of Guangzhou City, Guangdong Province, Guangzhou 510620, China; 2.Department of Ultrasonography, the 12th People′s Hospital of Guangzhou City, Guangdong Province, Guangzhou 510620, China

[Abstract] Objective To investigate the effects of human parathyroid hormone (hPTHl-34) on the osteoporosis of ovariectomized rats. Methods 50 female 7-month-old SD rats were used for this experiment and 30 of them were ovariectomized and another 20 received sham operation. After 12 weeks of ovariectomy the osteoporosis model was confirmed by use of 10 ovariectomized and sham-operated rats. The osteoporotic rats of 20 were randomly divided into 2 treatment groups: hPTHl-34 and OVX placebo groups with 10 rats in each group, the other 10 rats were sham-operated as the control for SHAM group. Totally hPTHl-34 (20 μg/kg) were subcutaneous injected into the rats of hPTHl-34 group once every other day. The rats of the OVX placebo group and SHAM group were injected with 0.5 mL saline once every other day. The bone mineral density (BMD), serurn Ca, P, bone alkaline phosphatase (BALP), serum tartrate-resistant acid phosphatase 5b (Trap-5b) were measured after 3 months therapy. Results After 12 weeks′treatment the femoral and lumbar BMD in the hPTHl-34 group increased obviously compared with those of OVX placebo group [(0.151±0.008) g/cm2 vs (0.135±0.013) g/cm2, (0.181±0.010) g/cm2 vs (0.159±0.008) g/cm2, P < 0.01]. After treated with hPTHl-34 serum Ca, P, BALP and Trap-5b significantly increased compared with those of OVX placebo group (P < 0.05 or P < 0.01). There was no significant difference in hPTHl-34 and SHAM groups. Conclusion hPTHl-34 can stimulate osteoblast activity, inhibite bone resorption, promote bone mass effect and is effective on protection against osteoporosis.

[Key words] Human parathyroid hormone; Osteoporosis; Bone mineral density; Bone turnover markers

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種全身性骨病，以骨量減少和骨的微結構破壞為特征，使骨的脆性增加，并易發生骨折[1]，嚴重影響患者的生活質量。而長期臥床又可加重骨質疏松，并引發其他心肺疾患以致形成惡性循環，甚至造成死亡，給患者、家庭和社會都帶來了沉重的社會及經濟負擔。隨著老齡化社會的到來，骨質疏松癥發病率逐年增長，據統計2005年美國有近250萬人次因骨質疏松性骨折就診，有43.2萬患者因此入院，約18萬患者需要家庭護理[2]，目前全球約有2億患者，中國約9千萬患者[3]，已經成為全球所面臨的重要健康問題。通常臨床上以骨密度（BMD）作為診斷和評價藥物療效的指標，由于BMD是通過測量骨質量反應骨質疏松的情況，作為療效評價指標存在一定的滯后性，不能對患者治療中骨代謝情況進行有效監測。2011年美國臨床內分泌學會制定的絕經后婦女骨質疏松診斷及治療指南中提出，骨轉換指標可以為骨折風險預測和療效監測提供及時有效的信息[4]。近年來，國外研究表明，小劑量間歇性皮下注射重組人甲狀旁腺素1-34（hPTH1-34）對松質骨有合成作用，但對皮質骨骨量和骨質量是否有影響及有何種影響尚存在爭議[5]。本研究觀察了低劑量、間歇性皮下注射hPTH1-34對去卵巢大鼠股骨和腰椎BMD、血清生化指標鈣、磷及骨轉換指標如骨源性堿性磷酸酶（BALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（Trap-5b）的影響，初步探討了其作用機制，為hPTH1-34治療絕經后骨質疏松提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 造模及分組

選擇7個月齡，體重（280±20）g，雌性，清潔級SD大鼠，由廣東省醫學實驗動物中心提供，共50只。購置動物后適應1周分別進行去卵巢（OVX）和假手術（SHAM）。在無菌條件下，將5%氯胺酮注射液按100 mg/kg體重給大鼠作腹腔注射麻醉，取腰椎兩旁切口進入腹腔背側，在雙側腎臟下方脂肪組織內確認卵巢后，完整切除卵巢，術后腹腔內滴入3%過氧化氫，止血縫合，傷口酒精消毒[6]。SHAM組麻醉與手術方法均相似，保留卵巢，僅切除少許脂肪。大鼠給于標記后每5只一組分籠飼養，飼養環境溫度為（25±3）℃，取12 h晝夜照明節律，相對濕度58%的環境，普通大鼠標準飼料喂養（鈣含量1.33%，磷含量0.95%），自由飲水。有死亡大鼠立即造模補充，并相應延長補充大鼠的飼養時間。術后12周隨機取SHAM組和OVX組各10只，放血處死時均檢查雙側卵巢是否完全切除和子宮是否萎縮，取腰椎做BMD測定，確認骨質疏松模型建立后進行實驗分組。共分為3個組：OVX安慰劑組（摘除大鼠雙側卵巢12周后不作任何處理，12周時與相鄰組同時測BMD）、hPTH1-34治療組（摘除大鼠雙側卵巢12周時測BMD后用hPTH1-34治療12周），SHAM組（僅切除卵巢周圍的脂肪組織約3 g，術后12周時測BMD）。

1.2藥物治療的途徑和方法

hPTH1-34治療組給予hPTH1-34（購于上海吉爾生化有限公司，批號：20130215，純度>95%），治療劑量為20 μg/kg，皮下注射，每周注射3次，連續12周；OVX安慰組和SHAM組皮下注射0.5 mL生理鹽水，每周注射3次，連續12周。所有實驗動物均服鈣爾奇12 mg/（kg·d）和2.5 U維生素D3，連服12周。每周測量體重，根據體重變化調整藥物劑量。各組動物于治療后12周，用3%戊巴比妥鈉麻醉，心臟采血取血標本，采用頸椎脫臼法處死去除軟組織，剝離腰椎段脊柱L1～6和右側股骨保存，用生理鹽水紗布包裹維持濕度，塑料袋密封后置于-70℃低溫冰箱中保存標本，以備BMD檢測。

1.3 觀察項目與方法

1.3.1 BMD測定應用雙能X線吸收法BMD測定儀（美國GE Lunar Prodigy公司生產）進行測定全身、腰椎段脊柱L1～6和右側股骨BMD。將標本相當于仰臥位放置于BMD儀探頭下，應用附帶的小動物軟件對其進行掃描得出BMD值。大鼠照射范圍：掃描長度為30.492 cm，掃描密度為17.912 cm，點分辨能力為0.0640 cm，精確度（CV） < 1%。結果以g/cm2表示。

1.3.2 生化指標測定三組大鼠全血5 mL離心分離血清，以美國Beckman公司的CX7全自動生化分析儀立即測定血鈣、血磷及BALP含量。采用酶聯免疫吸附（ELISA）法測量血清Trap-5b，試劑盒購自芬蘭SBA公司，批內差異3.0%，批間差異3.4%，該試劑盒只檢測新鮮釋放入血的具有酶活性的Trap-5b分子，在酶標儀上405 nm波長下讀取吸光度，標準品及樣品均行雙管測定，結果取兩次平均值，單位為U/L[7]。

1.4統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠骨質疏松模型鑒定

大鼠的腰椎和股骨遠端富含松質骨，股骨干富含皮質骨，OVX后骨質疏松癥模型是否建立主要以子宮濕重和松質骨的BMD來判斷。OVX組雙側卵巢摘除12周后，子宮濕重較SHAM組明顯下降，差異有高度統計學意義（P < 0.01），股骨、腰椎BMD較SHAM組明顯下降，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01），表明骨質疏松模型造模成功，見表1。

2.2 hPTH1-34對骨質疏松大鼠股骨、腰椎BMD的影響

OVX安慰劑組大鼠股骨、腰椎BMD較SHAM組明顯降低差異有統計學意義（P < 0.05）。hPTH1-34組治療12周后，與OVX安慰劑組比較，治療組的股骨、腰椎BMD明顯升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01，但與SHAM組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

表2 hPTH1-34對骨質疏松大鼠股骨、腰椎BMD的影響（g/cm2，x±s）

注：與OVX安慰劑組比較，*P < 0.05，#P < 0.01；BMD：骨密度

2.3 hPTH1-34對骨質疏松大鼠生化指標的影響

OVX安慰劑組大鼠血清鈣、磷、ALP、Trap-5b值較SHAM組明顯低。治療12周后，與OVX安慰劑組比較，hPTH1-34 治療組的血清鈣、磷、ALP、Trap-5b值明顯升高（P < 0.05或P < 0.01），但與SHAM組相比差異無統計學意義（P > 0.05）。見表3。

表3 重組人甲狀旁腺素1-34對骨質疏松大鼠

生化指標水平的影響（x±s）

注：與OVX安慰劑組比較，*P < 0.05，#P < 0.01；BALP：骨源性堿性磷酸酶；Trap-5b：抗酒石酸酸性磷酸酶-5b

3 討論

甲狀旁腺素是甲狀旁腺主細胞分泌的一種激素，含有34個氨基酸殘基，是調節鈣磷代謝的主要激素之一。hPTH1-34與天然甲狀旁腺素氨基酸結構完全一致，具有相同的受體親和力和生理作用，可以通過增加成骨細胞及破骨細胞數目，促進骨吸收及生長，刺激骨松質層和骨皮質層的新骨形成效應，改善骨小梁微結構，增加骨量、BMD和骨強度[8]。2002年12月美國FDA和歐洲批準了PTH應用于臨床治療絕經后和男性骨質疏松癥。目前認為，PTH對骨代謝具有雙向調節作用：持續升高的PTH能通過骨鈣入血，維持血鈣水平，最終骨量減少；治療作用表現在有計劃、小劑量、間斷給予PTH可顯著促進骨形成[9]。

絕經后骨質疏松癥動物模型于1969年首先由Saville通過切除大鼠卵巢來建立，后被反復證實并被廣泛采用，目前已成為標準化的公認的絕經后骨質疏松癥病理模型。文獻報道SD雌鼠去卵巢至12周左右骨質疏松癥病理模型能夠復制成功[10]。筆者在實驗中術后12周成功制作去卵巢大鼠骨質疏松癥模型，認為造模因素單一，模型確定，重復性好，實驗結果可信度大。骨強度的大小除了與骨結構有關外，更主要的是與骨量相關，骨強度的60%～80%都是由骨量來決定的，骨量與骨強度成正比例關系，而BMD是全面評價骨量和診斷骨質疏松癥的可靠指標，也是衡量臨床骨質疏松癥治療效果的評價指標[11]。在本研究中筆者發現hPTH1-34治療組股骨和腰椎BMD較OVX安慰劑組明顯升高，且以松質骨為主的腰椎BMD升高率較皮質骨為主的股骨更加明顯（P < 0.01或P < 0.05），與SHAM組無差異，提示了hPTH1-34治療不僅能保護松質骨骨量，阻擋松質骨骨量的繼續丟失，預防骨質疏松癥的進一步加重，而且明顯加重和恢復已丟失的骨量，使松質骨骨量達到了正常水平。

由于骨骼由生理變化反應到BMD的變化存在著滯后性，以BMD作為療效觀察指標敏感性和時效性均較差，臨床中需要快速、靈敏及有效的檢測指標用于原發性骨質疏松癥的療效監測。雌激素減少后，骨轉化增加，骨吸收大于骨形成，導致骨量的丟失，血液中骨代謝指標能敏感地反映骨骼的變化情況，如血清骨轉換標志物BALP、Trap-5b等，有關PTH治療對骨轉換等生化指標的影響報道不一[12]。BALP是組織非特異性堿性磷酸酶的一種特殊形式，由成熟階段成骨細胞合成并分泌，與細胞外骨基質結合，是最常見的評價骨形成和骨轉換的生化指標，可特異敏感性反映骨形成的活躍程度[13]。Trap-5b可反映破骨細胞的活性。本實驗中通過檢測去卵巢骨質疏松大鼠hPTH1-34治療期間BALP、Trap-5b水平，分析骨轉換指標在療效監測中的價值，OVX大鼠每周3次皮下注射20 μg/kg的hPTH1-34，治療3個月的結果顯示，OVX安慰劑組大鼠血清BALP、Trap-5b水平明顯低于SHAM組，證明由于雌激素水平下降，導致骨轉換加快，骨形成也加快，是高轉換型骨質疏松。而hPTH1-34組治療12周后，血清中的BALP、Trap-5b水平均明顯高于OVX安慰劑組，提示PTH可以降低大鼠去卵巢增加的骨轉化，骨形成速率得到提高。研究還發現BALP作為療效觀察指標在監測hPTH1-34治療原發性骨質疏松癥中可能更為敏感，可以為臨床提供更具時效性的數據。在促進骨合成的治療過程中，BALP均持續升高，表明患者骨形成活躍。有研究證實OVX后大鼠破骨細胞數量持續下降而活性持續升高，破骨細胞數量與血清Trap-5b水平密切相關，在OVX大鼠，血清Trap-5b水平變化并不能真正代表破骨細胞骨吸收活性的變化，而在更大程度上代表破骨細胞數量的變化[14]。本研究結果提示在促進骨合成的治療中，同時聯合血液骨轉換標志BALP、Trap-5b等的監測可以彌補單純觀察BMD導致敏感性欠缺的不足，了解用藥是否規范，及時調整治療方案，有助于更準確地判斷藥物的療效及依從性，為臨床治療提供實驗依據。

骨鹽的主要成分是鈣和磷，是骨基質的基本原料，當骨鹽的流失到一定的程度，體內鈣和磷就缺乏，引起血液鈣和磷水平的降低。骨中鈣維持著骨骼的強度。鈣流失過多，骨的顯微結構發生改變，則骨強度減弱。鈣代謝受多種因素影響，其中之一就是雌激素的水平。雌激素作用于成骨細胞，拮抗了糖皮質激素對成骨細胞生長的抑制，阻滯了鈣過多的從骨骼中游離出來[15]。本實驗中，大鼠OVX后，鈣含量顯著降低，提示OVX能影響鈣代謝，使骨骼中鈣流失過多。hPTH1-34治療12周后，血鈣、磷含量顯著增加，明顯高于對照組，提示鈣、磷代謝得到改善，考慮原因：PTH是血鈣、磷的主要調節激素，文獻報道PTH可增加1，25（OH）2VitD水平，后者促進腸鈣、磷吸收增加和尿磷排泄減少所致[16]。

因有試驗結果提示使用hPTH1-34可能會增加小鼠癌癥（如骨肉瘤）的傾向，雖然在本實驗未發現，但在臨床應引起重視，其影響有待進一步觀察與探討[17]。總之，hPTH1-34能增強骨合成代謝，抑制骨吸收，對股骨、腰椎骨量和BMD有增高作用，是治療絕經后骨質疏松癥非常有前景的藥物。

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（收稿日期：2014-03-01本文編輯：衛軻）

[基金項目] 廣東省醫學科學技術研究基金課題（編號WST JJ20121212430682197109140015）。