植物中miRNA及其靶基因mRNA剪切位點的常用檢測方法

金安娜

（長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025；中國科學院華南植物園，廣東 廣州 510650）

李建雄

（中國科學院華南植物園，廣東 廣州 510650；長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025）

田志宏

（長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025）

成熟的miRNA（microRNA）是一類由19～24個核苷酸 （nt）組成的內源非編碼小分子單鏈RNA，其5′端為磷酸基團，3′端為羥基基團［1］。相關資料表明，多數miRNA基因位于蛋白質編碼基因的內含子中或是基因間序列中，少部分位于外顯子中［1－2］；miRNA基因呈多順反子形式排布。同一基因家族的miRNA具有很高的同源性。由于miRNA進化上的保守性使得不同物種之間的miRNA也具有較高的同源性，如擬南芥 （Arabidopsis thaliana）和水稻 （Oryza sativa）。miRNA的表達具有時空特異性，例如不同發育時期、不同組織器官中的表達量存在差異。同一個miRNA可作用于多個不同的靶基因，同一個靶基因也可能受多個miRNA調控。

1 成熟miRNA的生成過程

miRNA廣泛存在于各種真核生物中，其在植物中的合成過程可簡述如下:miRNA基因首先在RNA聚合酶II（Pol II）的作用下轉錄形成初級轉錄產物——長鏈的pri－miRNA，隨后在其5′端和3′端分別形成帽子結構和poly（A）結構。此時的長鏈pri－miRNA通過分子內堿基互補配對形成具有特殊的發夾結構、不完全互補的雙鏈RNA。接著由具有識別pri－miRNA莖環結構的Dicer Like 1（DCL 1）和雙鏈RNA結合蛋白HYPONASTIC LEAVES1（HYL1）的共同作用下剪切成含有穩定的莖－環二級結構前體 miRNA，即pre－miRNA［2］。隨后 DLC1－HYL1復合體再將pre－miRNA 剪切形成 miRNA／miRNA＊復合物。此時，HUA Enhancer I（HEN 1）專一的將雙鏈的miRNA／miRNA＊3′末端進行甲基化修飾，以保護其穩定性防止被酶或被polyU降解［3］。接著由轉運蛋白HST （HASTY）將雙鏈的miRNA／miRNA＊從細胞核轉運至細胞質，此時的miRNA仍為雙鏈結構。該復合物進入細胞質中隨后開始解鏈，其中單鏈miRNA＊5′端由于穩定性較差被降解，而成熟的單鏈miRNA在ARGONAUTE 1（AGO 1）蛋白的輔助下被特異地整合到RNA誘導的沉默復合物RISC（RNA induced silencing complex）中，形成非對稱的RISC復合物，并以堿基互補的方式與匹配的靶基因mRNA相結合，從而介導靶基因特異位點的切割或抑制翻譯，進而調控靶基因mRNA的表達 （圖1）［1，4］。

圖1 成熟miRNA的形成過程

2 miRNA對靶基因mRNA的調控類型

通常情況下，miRNA與靶基因mRNA的作用模式主要有2種。一種作用模式是將成熟的單鏈miRNA與靶基因mRNA的3′UTR區不完全互補配對，從而阻斷靶基因mRNA的翻譯，進而調節基因表達［5］。這種方式主要影響蛋白表達水平而不影響靶基因mRNA的穩定性。另一種作用模式是當miRNA與靶基因mRNA完全互補配對時，則與miRNA相關的核糖核酸和RNA沉默復合物 （RISC）聯合作用降解靶基因 mRNA［1，5］。

3 miRNA的檢測技術

1993年，Lee等［6］在線蟲發現了第一個miRNA——可定時調控胚胎后期發育的lin－4基因。近年來，隨著miRNA的不斷發現，其檢測方法也得到了廣泛的拓展。目前miRNA的檢測方法大致可歸納為2類:（1）無需對樣本進行擴增的直接探針雜交法，如Northen blotting、Microarray等。（2）基于樣品擴增反應的檢測方法，如PCR與熒光染料SYBR GREEN的定量檢測法、滾環擴增法 （RCA）、引物入侵法 （Invader）和克隆法等［7－8］。這里主要詳細介紹第二類方法中的采用熒光染料的定量PCR檢測技術。

3.1 polyA聚合酶加尾法檢測miRNA

polyA聚合酶加尾法 （poly（A）tailing assay）可按以下步驟進行:poly（A）聚合酶 （PAP）在成熟的miRNA3′末端添加poly（A）尾巴；用5′端帶有接頭的poly（T）引物 （poly（T）Adapter）進行反轉錄反應合成miR cDNA。此poly（T）Adapter引物 （5′－GCGAGCACAGAATTAATACGACTC ACTATAGG （T）12VN－3′）由2部分組成，一部分為poly（T）12VN （V＝ A，G，C；N＝ A，T，G，C），另一部分為隨后PCR擴增設置的通用反向引物5′－GCGAGCACAGAATTAATACGAC－3′。以miR cDNA為模板，利用接頭的polyT引物 （polyT adapter）上的反向通用引物和miRNA特異的正向引物進行SYBR GREEN實時定量PCR擴增［9－10］（圖2）。

圖2 polyA聚合酶加尾法檢測miRNA表達量原理 （引自Shi et al［9］，2005）

3.2 引物延伸法檢測miRNA

引物延伸法 （primer extension assay，PE）利用一種新的寡聚核苷酸——鎖核酸 （locked nucletic acid，LNA）。LNA是一種特殊的雙環狀寡核苷酸衍生物，位于核酸的2′O，4′C可通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋并連接成環狀，以增加磷酸鹽骨架局部結構的穩定性，加強DNA／RNA的雜交親和力［11］。該方法首先利用特異性引物 GSP （5′－CATGATCAGCTGGGCCAAGAXXXXXXX－3′，3′端 的 X為7～12個與miRNA反向互補的堿基）進行逆轉錄反應合成miR cDNA；以miR cDNA為模板，利用逆轉錄引物5′上的正向通用引物 UP （5′－CATGATCAGCTGGGCCAAG－3′）和 含 有 2 個LNA修飾的且與miRNA互補配對的反向引物RP（大致16個堿基）進行SYBR GREEN實時定量PCR擴增［12］（圖3）。

圖3 引物延伸法檢測miRNA表達量原理（引自Raymond et al［12］，2005）

3.3 Multiplexed RT法檢測miRNA

Multiplexed RT法 （Multiplexed RT assay）的操作過程如下:將所需研究的相關miRNA的特異反轉錄引物 （RT Primer）等量混合，其過程類似于構建1個RT引物庫，但只需進行1次反轉錄反應即可得到所需的miR cDNA。然后針對不同的miRNA設計特異的正反向引物，加入SYBR GREEN進行實 時 定 量 PCR 擴 增［7，12］。Multipl－exed RT法的特點在于可區分同一miRNA基因家族內的不同成員；還可以檢測得到不同miRNA的表達量差異。該技術中的引物設計方法如下:RT引物由2部分組成，一部分為來自Wang的研究中提及的獨特標簽序列22bp［13］；另一部分為miRNA 3′端的6～11個反向互補特異序列。Forward primer即為獨特標簽序列 （22bp），Reverse primer由隨機序列 （4～11bp）和miRNA 5′端的正向特異序列 （21～22bp）組成。所設計的引物篩選條件為:TM值在61～63℃間，GC含量在45%～55%，避免引物自身二級結構和引物之間二級結構等［13］（圖4）。

圖4 Multiplexed RT法檢測miRNA表達量原理（引自 Wang et al［13］，2009）

3.4 miR－Q法檢測miRNA

miR－Q法 （miR－Q assay）分3步進行:首先，利用通過1個加尾的miRNA特異性逆轉錄引物RT6－miR－x將 miRNA 反 轉 錄 成 加 尾 cDNA。RT6－miR－x （5′－TGTCAGGCAACCGTATTCACCGTGAGTGGTXXXXXX－3′）由2部分組成，一部分為通用引物 MP－fw 序列 （5′－TGTCAGGCAACCG－TATTCACC－3′），另一部分為 3′端的6個與miRNA反向互補的堿基。其 次， 引 入 short－miR－x－rev引物合成雙鏈 DNA。short－miR－x－rev引物 （5′－CGTCAGATGTCCGAGTAG AGGGGGAACGGCGXXXXXX－3′）由2部分組成，一部分為通用引物 MP－rev序列 （5′－CGTCAGA TGTCCGAGTAGAGG－3′），另一部分為3′端miRNA的自身6個堿基序列。最后，加入引物 MP－fw和 MP－rev進行SYBR GREEN實時定量PCR擴增［14］（圖5）。

圖5 miR－Q法檢測miRNA表達量原理（引自Sharbati Tehrani et al［14］，2008）

3.5 Stem－loop RT－qPCR法檢測 miRNA

莖環法通過引入莖環從而延長miRNA的長度以便于片段的擴增。Stemp－loop法通用莖環為5′－GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACXXXXXX－3′ （3′端 為 6 個 與miRNA反向互補的堿基），由44bp組成1個8核苷酸環和20核苷酸莖的結構，反轉錄合成miR cDNA；其反轉錄程序為:16℃30min；30℃30s，42℃30s，50℃1s，60個循環；70℃10min。與miRNA互補配對的為正向引物Forward Primer，與莖環互補配對的通用引物Reverse Primer（5′－CCAGTGCAGGGTCCGAGGT－3′）為反向引物。最后進行SYBR GREEN實時定量PCR擴增。該方法具有樣品所需量少、靈敏度高、檢測范圍廣泛等優點［15－16］（圖6）。

4 miRNA對靶基因mRNA的切割位點的檢測技術

4.1 3′PPM－RACE （poly （A）polymerase－mediated 3′rapid amplification of cDNA ends）技術

通過miRNA對靶基因mRNA的識別剪切，剪切后產生1個5′剪切片段和1個3′剪切片段。其中，5′剪切片段包含5′帽子結構和3′羥基基團；3′剪切片段則包含5′磷酸基團和3′polyA尾巴。與5′RLM－RACE不同的是3′PPM－RACE技術選取含有帽子結構的5′剪切片段，在poly（A）聚合酶（PAP）的作用下添加1段polyA尾巴。隨后用特異 的 逆 轉 錄 引 物 dT30RT primer ［5′－ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd （T）30（A，G or C）（A，G，C，or T）－3′］合成cDNA。使用接頭的通用引物和基因的特異性引物進行PCR擴增反應［17－18］（圖7A 路徑）。

圖6 莖環法檢測miRNA表達量原理（引自Chen et al［15］，2005）

圖7 3′PPM （A）和5′RLM－RACE （B）技術原理 （引自 Wang et al［20］，2012）

4.2 5′RLM－RACE （RNA ligase－mediated 5′rapid amplification of cDNA ends）技術

在植物中，靶基因的切割是miRNA最主要的作用方式，其作用結果是靶基因mRNA被miRNARISC復合體在靶位點切斷。采用T4RNA連接酶介導的5′RLM－RACE方法可以檢測被切斷的靶基因mRNA，而其做法區別于常規5′RACE［18］。5′RLM－RACE先用T4RNA連接酶在被剪切后的mRNA的5′端加上1個 RNA Adapter （5′－CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUA GAAA－3′），再將連有接頭的RNA進行沉淀。接著用oligo d（T）18或隨機引物進行反轉錄反應。將cDNA進行一定倍數的稀釋后，然后用接頭上的2個特異引物和2個基因特異引物 （GSP1和GSP2）進行 巢式 PCR 擴 增。其中 RACE OUTER PRIMER 為5′－CGACTGGAGCACGAGGACACTGA－3′，RACE INNER PRIMER為5′－GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA－3′。然后回收凝膠產物，進行純化后，連接在T載體中克隆、測序鑒定切割位點［17，20－25］。

被miRNA－RISC復合體切斷的靶基因mRNA有別于完整的mRNA，后者有5′帽子結構，所以不能連接RNA接頭，在反轉錄后PCR中不能被擴增。被切割的靶基因mRNA相對于隨機斷裂的mRNA，其切割位點是固定的，因此，在5′RLM－RACE結果中，沿mRNA序列隨機斷裂位點呈隨機分布，而在切割位點處呈現出異常高的克隆頻次。這種5′RLM－RACE方法在單個miRNA研究中已被廣泛應用并被證明是有效的 （圖7B路徑）。

4.3 PARE （parallel analysis of RNA ends）技術

隨著測序技術的發展，加之植物miRNA在調控靶基因的表達時通常具有與靶基因mRNA幾乎完全匹配的特點，2008年又出現了一種結合高通量測序技術、生物信息學分析和RACE驗證三者優勢的新的檢測方法，稱為PARE技術 （parallel analysis of RNA ends），又稱為降解組測序技術 （degradome sequencing）［26］。

植物中大部分miRNA與靶基因mRNA間完全或幾乎完全互補配對，并在互補位點的第10或11位核苷酸上發生切割作用以調控靶基因的表達。miRNA對靶基因mRNA切割后產生1個5′片段和1個3′片段。其中，5′片段包含5′帽子結構和3′羥基基團；3′片段則包含5′磷酸基團和3′polyA尾巴。在T4 RNA連接酶的作用下 RNA 接頭 RNA dapter （5′－GUUCAGAGUUCUACAGUCCGAC－3′）可與5′單磷酸RNA連接而與含有帽子結構的5′剪切片段或其他缺少5′單磷酸基團的RNA無法連接，這一點的原理同5′RLM－RACE一致。用oligo d （T）Primer（5′－CGAGCACAGAATTAATACGACT （21）V－3′）將連接有RNA Adapter的3′切割產物反轉錄成cDNA。將反轉錄后的cDNA加入通用前引物 （5′－GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC－3′）和后引物 （5′－CGAGCACAGAATTAATACGAC－3′）按以下程序擴增6個循環:94°C 30s，60°C 20s，72°C 3min。由于該RNA Adapter上存在1個限制性內切酶Mme I識別位點，可識別位點下游20bp處進行切割。Mme I進行酶切反應，隨后在T4DNA連接酶的作用下使酶切產物與雙鏈DNA adapter連接，其雙鏈DNA adapter的上鏈序列為5′－TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG－3′，下鏈序列5′－CAAGCAGAAGACGGCATACGANN－3′。使用 RNA 接頭的通用引物Forward Prime （5′－GGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC－3′）和DNA接頭的通用引物 Reverse Prime（5′－CAAGCAGAAGACGGCATACGA－3′）進行PCR擴增，然后純化膠回收產物進行深度測序［19，27－34］（圖8）。

圖8 PARE技術原理 （引自Thomson D W et al［26］，2011）

5 結語

自1993年Lee發現第一個miRNA，近年來miRNA的研究及其發展日益增多。研究表明，miRNA參與了大多數生物的生長發育、逆境適應和應激反應等生命活動，但多數miRNA參與其中的具體分子機制尚未明了，仍有待研究。

因此，了解和掌握miRNA的實時定量檢測技術，使它們在具體生命活動過程中的表達活性可進行差異性對比，有助于研究多數miRNA的高度保守性、時空特異性，可探究miRNA的相關功能。基于上述5種miRNA的定量檢測技術，將其不同方法的優點及區別簡述如下:PolyA聚合酶加尾法特異性極其靈敏性相對較一般，末端的甲基可能影響Poly（A）的添加，但操作簡單；引物延伸法特異性強，可區分同一基因家族成員，但操作過程繁瑣；Multiplexed RT法特異性和靈敏性好，一次操作便可得到多個miRNA的信息，但其引物設計過程復雜；miR－Q法對豐度的要求多靈敏性較差，引物設計過程相對簡單；莖環法為近年來常用的首選方法，其操作費用低廉，操作過程簡單，對樣品的豐度要求低，靈敏性很好，引物設計過程簡單。

根據所需研究的miRNA結合生物信息學，預測其靶基因mRNA，通過介紹的3種靶基因的剪切位點的檢測技術進行相關實驗驗證。3′PPM－RACE技術和5′RLM－RACE技術是基于RACE技術，但又不同于常規RACE技術的檢測靶基因切割位點的方法，其在操作驗證中已被證明有效，相關試劑盒的開發也使實驗操作簡便高效；PARE技術在近年來測序技術的成熟下，逐漸被越來越多地使用，可以預測到同一miRNA的不同靶基因，操作過程稍微繁瑣，但可得到廣泛的信息。

［1］Jover－Gil S，Candela H，Ponce M R.Plant microRNAs and development［J］.Int J Dev Biol，2005，49:733－744.

［2］Tomari Y，Zamore P D.MicroRNA biogenesis:drosha can’t cut it without a partner［J］.Curr Biol，2005，15:61－64.

［3］Yu B，Yang Z，Li J，et al.Methylation as a crucial step in plant microRNA biogenesis［J］.Science，2005，307:932－935.

［4］Baumberger N，Baulcombe D C.Arabidopsis ARGONAUTE1is an RNA slicer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102:11928－11933.

［5］Chen X.MicroRNA biogenesis and function in plants ［J］.FEBS Lett，2005，579:5923－5931.

［6］Lee R C，Feinbaum R L，Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin－4encodes small RNAs with anti－sense complementarity to lin－14 ［J］.Cell，1993，75:843－854.

［7］陳新，曾長英，盧誠.基于PCR技術的miRNA定量檢測方法 ［J］.中國生物工程雜志，2010，30（11）:88－93.

［8］景花，宋沁馨，周國華.MicroRNA定量檢測方法的研究進展遺傳 ［J］.遺傳，2010，32（1）:31－40.

［9］Shi R，Chiang V L.Facile means for quantifying microRNA expression by real time PCR ［J］.Biotechniques，2005，39:519－525.

［10］Zeng C Y，Wang W Q，Zheng Y，et al.Conservation and divergence of microRNAs and their functions in Euphorbiaceous plants［J］.Nucleic Acids Research，2009:981－995.

［11］Petersen M，Wengel J.LNA:a versatile tool for therapeutics and genomics［J］.Biotechnology，2003，2:74－81.

［12］Raymond C K，Roberts B S，Garrett－Engele P，et al.Simple，quantitative primer－extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short－interfering RNAs ［J］.RNA，2005，11:1737－1744.

［13］Wang X W.A PCR－based platform for microRNA expressionp rofiling studies［J］.RNA，2009，15:716－723.

［14］Sharbati－Tehrani S，Kutz－Lohroff B，Bergbauer R，et al.miR－Q:a novel quantitative RT－PCR approach for the expression profiling of small RNA molecules such as miRNAs in a complex sample［J］.BMC Molecular Biology，2008，9:34－46.

［15］Chen C，Ridzon D A，Broomer A J，et a1.Rea1－time quantification of microRNAS by Stemloop RT－PCR ［J］.Nuc1eic Acids Res，2005，33:179－187.

［16］Yang H P，Schmuke J J，Flagg L M，et al.A novel real time polymerase chain reaction method for high throughput quantification of small regulatory RNAs［J］.Plant Biotech J，2009，7:621－630.

［17］Song C，Yu M，Han J，et al.Validation and characterization of citrus sinensis microRNAs and their target genes［J］.BMC Research Notes，2012，5:235－243.

［18］Shangguan L，Song C，Han J，et al.Characterization of regulatory mechanism of Poncirus trifoliate microRNAs on their target genes with an integrated strategy of newly developed PPM－RACE and RLM－RACE ［J］.Gene，2014，535:42－52.

［19］郭曉琴，孫紅正.microRNA靶基因檢測技術研究進展 ［J］.河南農業科學，2013，42（4）:11－13，18.

［20］Wang J，Yang X，Xu H，et al.Identification and characterization of microRNAs and their target genes in Brassica oleracea ［J］.Gene，2012，2:300－308.

［21］Sun X，Korir N K，Han J，et al.Characterization of grapevine microRNA and its target genes ［J］.Mol Biol Rep，2012，39:9463－9472.

［22］Wu G，Poethig R S.Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156and its target SPL3 ［J］.Development，2006，133:3539－3547.

［23］Maile R B，Kronengold J，Gazula V R，et al.Amino－termini isoforms of the Slack K＋channel，regulated by alternative promoters，differentially modulate rhythmic firing and adaptation ［J］.J Physiol，2008，5161－5179.

［24］Davis M E，Zuckerman J E，Hang C，et al.Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles［J］.Nature，2010，464:1067－1071.

［25］Coutts R H A，Livieratos I C.A Rapid Method for Sequencing the 5′and 3′Termini of Double－Stranded RNA Viral Templates using RLM－RACE ［J］.J Phytopathology，2003，151:525－527.

［26］Thomson D W，Bracken C P，Gregory J.Survey and summary experimental strategies for microRNA target identification ［J］.Nucleic Acids Research，2011，39:6845－6853.

［27］Zhou M，Gu L，Li P，et al.Degradome sequencing reveals endogenous small RNA targets in rice（Oryza sativa L.ssp.indica）［J］.Front Biol，2010，5:67－90.

［28］董淼，黃越，陳文鐸，等.降解組測序技術在植物miRNA研究中的應用 ［J］.植物學報，2013，48（3）:344－353.

［29］German M A，Pillay M，Jeong D H，et al.Global identification of microRNA target RNA pairs by parallel analysis of RNA ends［J］.Nat Biotechol，2007，26:941－946.

［30］Li Y F，Zheng Y，Addo－Quaye C，et al.Transcriptomewide identification of microRNA targets in rice ［J］.Plant J，2010，62:742－759.

［31］Zhang J Z，Ai X Y，Guo W W，et al.Identification of miRNAs and their target genes uing deep sequenceing and degradome analysis in trifoliate orange（Poncirus trifoliate L.Raf）［J］.Mol Biotechnol，2012，51:44－57.

［32］Xu M Y，Dong Y，Zhang Q X，et al.Identification of miRNAs and their targets fromBrassica napus by highthrought sequengcing and degradome analysis ［J］.BMC Genomics，2012，13:421－428.

［33］Shamimuzzaman M，Vodkin L.Identification of soybean seed developmental stage specific and tissue specific miRNA targets by degradome sequencing ［J］.BMC Genomics，2012，13:310－318.

［34］Mao W，Li Z，Xia X，et al.A combined approach of high throughput sequencing and degradome analysis reveals tissue specific expression of microRNAs and targets in cucumber［J］.PLoS One，2012，7:330－340.