燈盞細辛離體葉片再生植株的研究1)

董志淵，楊麗英，王馨，李林玉，楊斌，馬維思，嚴世武，李紹平

(云南省農業科學院藥用植物研究所，云南昆明650200)

燈盞細辛(Erigeronbreviscapus)為菊科(Compositae)飛蓬屬多年生草本植物，又名燈盞花。以全草入藥，是云南重要的藥用植物和道地藥材，被云南省列為重點發展的五大系列藥品之一[1]。

燈盞細辛主要有效成分為黃酮類化合物燈盞乙素，其具有擴張腦血管，增加腦血流量，改善微循環作用，可用于治療缺血性腦血管疾病[2]。

燈盞細辛主要通過異花授粉[3]進行種子繁殖[4]，種質保存和品種選育難度較大。采用植物離體組織快繁技術，可對燈盞細辛優良單株進行保存和擴繁，獲得基因型一致的無性系群體，對育種工作具有重要意義。本研究主要采用燈盞細辛基生葉片為外植體，開展不同培養基配方對燈盞細辛離體培養過程中愈傷組織、不定芽形成，壯苗培養和離體植株生根等方面的影響，進一步優化燈盞細辛離體再生植株的技術方法，為燈盞細辛種質資源保存和育種應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

燈盞細辛(Erigeronbreviscapus)植株。

1.2 方法

1.2.1 接種

取生長正常健康的葉片，超菌工作臺上用70%的乙醇浸泡30s，2.00%NaOCl消毒約8min，無菌水清洗3次，切成寬約0.50cm的方塊，接種到不同激素配比的MS培養基上，誘導愈傷組織產生；培養20d后切取誘導產生的愈傷組織，接種到不同激素配比的不定芽誘導培養基上，誘導不定芽產生；培養30d后，將產生不定芽的愈傷組織轉接入壯苗培養基中，促進不定芽的生長；壯苗培養約60d后，植株高1～3cm，具4～8片葉片時，轉入不同激素配比的生根培養基中，誘導植株形成根系。

愈傷組織誘導率、不定芽誘導率和不定芽誘導系數的計算公式如下：

愈傷組織誘導率 = 產生愈傷組織葉片數 / 葉片總數

不定芽誘導率 = 產生不定芽的愈傷組織數 / 愈傷組織總數

不定芽誘導系數 = 不定芽總個數 / 愈傷組織總數

1.2.2 培養基配制

基本培養基為MS培養基，添加不同濃度的激素2，4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)、BA (6-芐基腺嘌呤)、IBA (吲哚丁酸)、NAA (萘乙酸)、KT (激動素)、GA(赤霉素)，附加物水解酪蛋白、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、活性炭，3.00%蔗糖，0.60%瓊脂，pH值5.80～6.00，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2.3 不定芽發生顯微觀察

以經過愈傷組織誘導、不定芽誘導和壯苗培養的愈傷組織塊為材料，采用FAA固定液進行固定，常規石蠟切片法切片，切片厚度10μm，鐵礬-蘇木精染色，脫水透明后在Phenix PH100顯微鏡下觀察不定芽發生過程，并用MICRO IMAGE MC-D310U(E)顯微攝影裝置進行攝影。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織誘導

研究結果表明，采用MS + BA 1.00mg/L + NAA (0.50 mg/L 或 0.25 mg/L)培養基，愈傷組織外部顏色為綠色，顆粒大，質地疏松，愈傷組織生長量較多；MS + BA 1.00mg/L + 2,4-D (0.50mg/L或0.25 mg/L)，愈傷組織為嫩綠色，顆粒狀小且緊密，愈傷組織生長量較少。上述4個培養基配方的愈傷組織誘導率均較高(89.36%～99.22%)，其中MS + BA 1.00mg/L + NAA 0.50 mg/L 培養基誘導率最高，達到99.22%(表1)。

表1 不同激素配比對愈傷組織誘導的影響

2.2 不定芽誘導

不同濃度的細胞分裂素BA對燈盞細辛不定芽誘導影響較大。較高濃度的細胞分裂素有利不定芽的形成，其中BA濃度為5.00mg/L，NAA濃度為1.00mg/L時，不定芽誘導率和誘導系數均較高，分別為30.84%和0.49(表2)。

表2 不同濃度的細胞分裂素BA對燈盞細辛不定芽誘導的影響

細胞分裂素BA、KT與生長素NAA、IBA不同激素配比的培養基對不定芽誘導影響明顯，其中MS + KT 4.00mg/L + IBA 0.50mg/L培養基有利不定芽的形成，不定芽芽誘導率和誘導系數均較高，分別為38.51%和0.49(表3)。

表3 不同激素配比對燈盞細辛不定芽誘導的影響

2.3 壯苗培養

在MS + BA 0.50mg/L + NAA 0.50 mg/L+水解酪蛋白1000.00 mg/L +PVP 1000.00 mg/L培養基中分別加入GA 0.00mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L，培養誘導獲得的不定芽。結果表明，GA 0.00mg/L時，不定芽在該培養基上能夠繼續生長，未發生明顯褐化現象，但生長較緩慢；添加赤霉素0.50mg/L時，不定芽生長較快，離體植株形態建成較好，部分發生玻璃花現象，添加1.00 mg/L的培養基中不定芽生長最快，離體植株形態建成較好，但玻璃花現象較嚴重(圖4：1)。

采用經過MS + BA 1.00mg/L + NAA 0.50 mg/L、MS + BA5.00mg/L + NAA1.00mg/L和MS + BA 0.50mg/L + NAA 0.50 mg/L+水解酪蛋白1000.00 mg/L +PVP1000.00 mg/L培養的愈傷組織塊，進行石蠟切片和顯微觀察。結果表明，通過不定芽培養，在愈傷組織塊的表層下或表層的部分細胞染色較深，細胞質濃密，細胞核明顯，形成分生組織，并發育形成不定芽原基(圖3：1～2)；通過壯苗培養，不定芽原基進一步分化，形成芽的明顯結構(圖3：3～4)。

圖3 愈傷組織不定芽形成

2.4 生根培養

表4 不同激素配比對燈盞細辛離體植株生根的影響

1/2MS + BA 0.25mg/L + NAA 2.00 mg/L + 活性炭0.30%、1/2MS + BA 0.25mg/L + IBA 2.00 mg/L + 活性炭0.30%等含較低濃度生長素的培養基不能誘導離體植株生根；1/2MS + BA 0.50mg/L + NAA 2.00 mg/L + IBA 2.00 mg/L + 活性炭0.30%、1/2MS + BA 0.50mg/L + NAA 3.00 mg/L + IBA 3.00 mg/L + 活性炭0.30%等含較高濃度生長素的培養基可誘導離體植株生根(表4；圖4：2)。

圖4 燈盞細辛離體葉片再生植株

3 討論

燈盞細辛組織培養中采用的外植體主要有花葶、花盤、葉片、葉柄等[5-6]。其中，葉片易獲得，數量多，是燈盞細辛組織培養較好的外植體來源。目前，以葉片為外植體，通過愈傷組織誘導、不定芽誘導和生根培養等步驟組成的燈盞細辛組織培養技術方法已初步形成。但不同研究者關于燈盞細辛組織培養中激素配比使用，及其對培養效果影響報道差異較大。

林麗飛等[7]采用KT、NAA和2,4-D配比的MS 培養基誘導燈盞細辛愈傷組織產生，其中KT 0.5 mg/L + 2,4-D 10 mg/L、MS + 2,4-D 0.5 mg/L + 6 -BA 0.5 mg/L 等培養基配方均能高效誘導愈傷組織產生。馬玉芳等[5]采用MS + 6-BA 1mg/ L + NAA 0.5mg/L培養基誘導愈傷組織產生，培養60d后才開始形成愈傷組織。本研究發現較低濃度激素BA、NAA和2,4-D配比的MS培養基可較好的誘導葉片愈傷組織產生，培養20d后大部分葉片可產生愈傷組織，誘導率達到89.36%以上。

關于燈盞細辛不定芽誘導，林麗飛等[7]采用MS +6-BA 0.5 mg/L +IBA (0、0.1、0.3、0.5 mg/L) + 10%香蕉汁的培養基可產生一定數量的不定芽；吳毅歆等[8]采用MS、MS+6-BA0.5 mg/L +NAA0.1 mg/L等較低激素配比培養基，不定芽誘導率均達到100%；黃衡宇等[6]研究表明不定芽誘導的適宜激素配比是BA 2.0 mg/L +IAA 1.0 m g/L 或 KT 3.0 mg/L +IAA 0.5 mg/L。本研究發現燈盞細辛愈傷組織不定芽誘導較困難，采用較高濃度的細胞分裂素，才能誘導不定芽的產生，MS + BA 5.00mg/L + NAA 1.00mg/L培養基不定芽誘導率為30.84%；不同激素配比對不定芽的誘導影響明顯，其中MS + KT 4.00mg/L + IBA 0.50mg/L培養基有利不定芽的形成，不定芽誘導率為38.51%。本研究還發現，愈傷組織誘導形成的不定芽呈芽點狀，在不定芽誘導培養基上較難繼續分化生長形成離體植株，并且容易發生褐化現象。因此本研究將誘導形成的不定芽轉接入含不同濃度赤霉素的MS + BA 0.50mg/L + NAA 0.5 mg/L+水解酪蛋白1000 mg/L +PVP1000 mg/L培養基，防止褐化，促進不定芽的生長，結果發現通過壯苗培養，特別是添加低濃度的赤霉素，不定芽生長明顯。

本研究還發現，燈盞花離體植株生根也需較高濃度生長素，如1/2MS + BA 0.50mg/L+NAA 2.00 mg/L + IBA 2.00 mg/L+活性炭0.30%、1/2MS+BA 0.50mg/L+NAA 3.00 mg/L+IBA 3.00 mg/L+活性炭0.30%等配方。含較高濃度生長素的培養基誘導燈盞細辛離體植株生根效果較好。該結果與黃衡宇等[7]、吳毅歆等[8]，關于燈盞細辛離體植株生根適宜培養基配方差別較大，還有待進一步研究。

[1] 邱璐,瞿禮嘉,虞泓,等.燈盞花的研究進展[J].中草藥,2005,36(1)：141-144．

[2] 國家藥典委員會．中國藥典(2005版，-部)[M]．北京：化學工業出版社，2005：100．

[3] 李鵬，黨承林．短葶飛蓬(Erigeronbreviscapus)的花部綜合特征與繁育系統[J]．生態學報，2007，27(2)：571-578．

[4] 俞宏淵，陳宗蓮．燈盞細辛的家化栽培[J]．云南植物研究，2002，24：115-120．

[5] 馬玉芳，許繼宏，梅慧．燈盞菊(Erigeronbreviscapus(vant. ) Hand - mazz)單株組培工廠化生產種苗技術研究[J]．云南大學學報(自然科學版)，2001，23 (植物學專輯)：113-116．

[6] 黃衡宇，李鵬，黨承林．藥用植物燈盞花的組織培養[J]．廣西植物，2008，28(5)：685-689．

[7] 林麗飛，陶發清，胡先奇，等．燈盞花組培快繁與植株再生[J]．安徽農業科學，2009，37(4)：1580-1581．

[8] 吳毅歆，謝慶華，桑林，等．燈盞細辛的組織培養與快速繁殖[J]．植物學通報，2005，22(1)： 54-57．