微生物傳感器的發展和應用

付 強 林初文 程立坤 陳 群

(1.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600；2.北京尚洋東方環境科技股份有限公司，中國 北京 100081)

微生物傳感器是使用微生物活細胞或細胞碎片作為敏感元件與電化學換能器來制備的生物傳感器。由于微生物傳感器的核心部分是具有生物活性的微生物細胞，與基于酶的生物傳感器相比，微生物傳感器不需要昂貴的純化過程，微生物在其數量、大小、繁殖、遺傳改造等方面均具有獨特的優勢，因此可以滿足環境監測中快速簡單、原位、低成本的要求。

1 微生物傳感器的發展簡介

自1975年Devis 制成了第一支微生物傳感器以來，微生物傳感器研制的關鍵技術在于微生物的固定，傳統的生物材料固定方法包括物理吸附、共價鍵合、交聯到一定的載體基質上或包埋于有機聚合物的基質中，然而這些方法都存在穩定期短和固定時引起微生物的損傷等缺陷，從而限制了微生物傳感器的發展。納米技術的出現提供另一種更好的固定方法，納米材料特有的光、電、磁、催化等性能，引起了凝聚態物理界、化學界及材料科學界的科學工作者的極大關注，這些進步推動了微生物傳感器的發展，現將微生物傳感器近年來應用情況概述如下。

2 應用

2.1 環境監測

生化需氧量，簡稱BOD，是水體中微生物分解有機物的過程中消耗水中溶解氧的量，以mg/L 表示。BOD 的測定對控制水體污染具有更重要的意義，傳統測定BOD 的方法需要5 天，用傳感器測定只需十幾至幾十分鐘，胡磊等[1]采用接枝二茂鐵為介體的微生物傳感器測量污水的BOD。結果表明，傳感器的線性范圍為2～300mg/L，能連續工作35 天，通過對實際水樣的測試表明，測得的BOD 與BOD5，具有良好的相關性。近年來，人們利用從污水和活性淤泥中富集的電化學活性微生物，構建了多種有介體或無介體微生物燃料電池（MFC）生物傳感器，同時發現MFC 電流（電壓）或電子庫侖量與電子供體的含量之間存在一定對應關系，據此，科研人員研制出用于廢水BOD[2]以及有毒物質[3]檢測的MFC 生物傳感器。

重金屬污染廣泛存在于環境中，它能通過生物富集作用對動植物及人類產生危害。利用分析化學方法檢測重金屬離子對其生物危害缺乏直接檢定，生物傳感器檢測重金屬離子吸引了越來越多的研究興趣。發光微生物傳感器是目前生物毒性測試中研究最多的微生物傳感器之一。最常用的生物發光系統是用于水體毒性實驗的Microtox 法評價。我國早在1995年就頒布了水質急性毒性的測定發光細菌法行業標準。但這些方法需要預先配制培養基、復蘇菌種等復雜過程，李書鉞[4]以明亮發光桿菌作為指示生物，研制的傳感器將可同時分析Pb2+、Cr6+、Cd2+、Hg2+、Cu2+對發光細菌的毒性作用，該傳感器與傳統實驗方法具有較高的相關性。此外據報道用小球藻[5]、銅綠假單胞菌烘干后死細胞[6]制成的微生物傳感器也可用于重金屬檢測。

甲醛含量已成為當今居室、食品、紡織品中污染監測的一項重要安全指標。湯鴻雁等[7]以枯草芽孢桿菌為固定化菌株，研制甲醛微生物傳感器，經測試，與乙酰丙酮分光光度法的測定結果有很好的一致性。此外，微生物傳感器可以快速、高效、靈敏、準確的檢測農 藥[8－9]殘 留。

2.2 食品和發酵工業

發酵工藝在食品、飲料等生產過程中應用廣泛，溫度、溶氧、pH、培養基成分、細胞濃度、產物組成及含量等均是發酵過程的重要控制參數。快速和準確的檢測技術對發酵過程控制具有重要的意義，目前葡萄糖、谷氨酸、乳酸的實時監控已得到廣泛應用。葡萄糖是發酵過程最重要的碳源。在這方面基于酶反應的生物傳感器研制最早且已商業化，微生物傳感器的研制較晚，但更具潛力，Liang 等[10]利用可表達葡萄糖脫氫酶的轉基因大腸桿菌構建一種新型微生物傳感器，其對葡萄糖的線性范圍為50～800umol/L，檢測限為4umol/L，可抗其他糖類干擾，可再生，成本低，具有良好的穩定性。

乙醇濃度是乙醇發酵、啤酒釀造工業過程中的主要控制參數，乙醇檢測在工業上具有特別重要的意義。Akyilmaz 等[11]用可產生乙醇氧化酶的熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）制成的安培計型傳感器可用于乙醇檢測，其對乙醇濃度的響應線性范圍為0.5～7.5mmol/L，響應時間為2min。Valach 等人[12]構建一個安培計型微生物傳感器可在流動注射分析（FIA）儀中測量乙醇，汪玉鳳等[13]利用以乙醇作為唯一碳源的嗜有機甲基桿菌（Methylobacterium organophilium）研制出基于氧電極的乙醇微生物傳感器，Wen 等[14]將嗜有機甲基桿菌固定于蛋膜結合氧電極研制出乙醇檢測傳感器，均取得滿意效果。

此外，Akyilmaz 等[15]將可產生賴氨酸氧化酶的啤酒酵母用戊二醛-明膠交聯固定到溶氧膜構建可檢測賴氨酸的微生物傳感器，經檢測該傳感器對賴氨酸的線性響應范圍為1.0 umol/L～10umol/L，響應時間為1min。

霉菌毒素是由霉菌或真菌產生的有毒有害物質，攝入時，霉菌毒素可能會導致急性或慢性中毒。高效準確的檢測霉菌毒素的含量對于食品安全具有重要的作用。據報道，以一株攜帶螢火蟲熒光素酶系統的轉基因釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）研制的微生物傳感器可檢測出牛奶中玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）的納摩爾級含量[16]。

2.3 臨床診斷

傳統技術對各種疾病的診斷是一個耗時、復雜的過程，這使得在緊急情況下急救護理變得困難。微生物傳感器在診斷激素、DNA 損傷等方面提供了一種快速、準確和廉價的方式。

Akyilmaz 等人[17]采用戊二醛交聯法將凍干的白腐真菌(Phanerochaete chrysosporiumME446) 固定在凝膠修飾的鉑電極上，研制出微生物傳感器用于測定腎上腺素，其檢測線性范圍為5～100umol/L，最低檢出限為1.04umol/L。

許多環境污染物可引起生物體內DNA 的損傷。DNA 損傷是一種極其重要的毒理作用，是誘發基因突變、癌癥發生和發育畸形的關鍵因素。與基于哺乳動物細胞的檢測方法相比細菌學檢測DNA 損傷的方法具有靈敏、快速、簡便、高通量以及可以在線、實時檢測等特點。Cheng 等[18]構建了在SOS 反應中起關鍵作用的recA 基因啟動子調控表達EGFP 基因的質粒，將其轉入大腸桿菌，開發出一種可靈敏檢測DNA 氧化損傷試劑的熒光細菌傳感器，可用于檢測醫院廢棄物、工業廢水、農業污染以及核工業污染等領域的環境致癌物，是一種非常有前途的檢測方法。

3 展望

目前應用最廣的是酶生物傳感器，其靈敏度較高、專一性較強且響應時間短，不過酶提取純化難度較大，酶的保存期限相對較短，極易失活，只有在適當的理化條件下或基于某些可溶性輔助因子基礎上酶才會產生作用。而依據某些微生物細胞制作的微生物傳感器沒有嚴格的理化條件限制，具有較長的保存期限，使用成本低，但也存在一些缺點，如再生速度慢，比酶電極響應時間長，由于微生物體內酶系復雜，處于一定情況下具有較差的選擇性和專一性，這將是科研人員需要努力改進的地方。微流控芯片技術(Microfluidics)，近幾年成為研究熱點，作為一種微型化的生化分析儀器，在生物、化學、醫學等領域具有巨大潛力，而電化學生物傳感器具有靈敏度高、易微型化、功耗小、成本低的特點，兩種技術的融合將是微生物傳感器的發展方向。比如開發一種便攜式的微陣列微生物傳感器，使其具備高通量、快速、選擇性高和集成化的功能，可同時檢測空氣、水、土壤中存在的多種污染，那對于環境保護工作將是何等便利。

［1］胡磊，李軼.基于接枝二茂鐵介體的BOD 微生物傳感器[J].水資源保護，2012(4)：78-81.

［2］M.Di Lorenzo，T.P.Curtis，I.M.Head，et al.A single-chamber microbial fuel cell as a biosensor for wastewaters[J].Water Res，2009，43(13)：3145-3154.

［3］Y.Shen，M.Wang，I.S.Chang，et al.Effect of shear rate on the response of microbial fuel cell toxicity sensor to Cu(II)[J].Bioresour Technol，2013，136：707-710.

［4］李書鉞.一種發光細菌快速水質毒性檢測儀的設計與研究[D].重慶大學，2011.

［5］J.Singh and S.K.Mittal.Chlorella sp.based biosensor for selective determination of mercury in presence of silver ions [J].Sensors &Actuators：B.Chemical，2012，165(1)：48-52.

［6］M.Yüce，H.Nazir and G.D o¨nmez.Utilization of heat-dried Pseudomonas aeruginosa biomass for voltammetric determination of Pb (II)[J].New Biotechnology，2011，28(4)：356-361.

［7］湯鴻雁.甲醛微生物傳感器的研究[D].河北科技大學，2010.

［8］X.Tang，T.Zhang，B.Liang，et al.Sensitive electrochemical microbial biosensor for p -nitrophenylorganophosphates based on electrode modified with cell surfacedisplayed organophosphorus hydrolase and ordered mesopore carbons[J].Biosensors and Bioelectronics，2014，60.

［9］M.U.Anu Prathap，A.K.Chaurasia，S.N.Sawant，et al.Polyaniline-based highly sensitive microbial biosensor for selective detection of lindane[J].Anal Chem，2012，84(15)：6672-6678.

［10］B.Liang，L.Li，X.Tang，et al.Microbial surface display of glucose dehydrogenase for amperometric glucose biosensor [J].Biosens Bioelectron，2013，45：19-24.

［11］E.Akyilmaz and E.Din?kaya.An amperometric microbial biosensor development based on Candida tropicalis yeast cells for sensitive determination of ethanol[J].Biosensors and Bioelectronics，2005，20(7)：1263-1269.

［12］M.Valach，J.Katrlík，E.Sˇturdík，et al.Ethanol Gluconobacter biosensor designed for flow injection analysis.Application in ethanol fermentation off-line monitoring[J].Sensors and Actuators，B：Chemical，2009，138(2)：581-586.

［13］汪玉鳳，劉增倫，王焱.基于氧電極的乙醇微生物傳感器的在線檢測系統[J].傳感器與微系統，2011，30(1)：110-111，115.

［14］G.M.Wen，S.M.Shuang and C.Dong.An ethanol biosensor based on a bacterial cell -immobilized eggshell membrane [J].CHINESE CHEMICAL LETTERS，2012，23(4)：481-483.

［15］E.Akyilmaz，A.Erdogan，R.Ozturk，et al.Sensitive determination of L-lysine with a new amperometric microbial biosensor based on Saccharomyces cerevisiae yeast cells[J].Biosens Bioelectron，2007，22(6)：1055-1060.

［16］A.-L.Va¨limaa，A.T.Kivisto¨，P.I.Leskinen，et al.A novel biosensor for the detection of zearalenone family mycotoxins in milk [J].Journal of Microbiological Methods，2010，80(1)：44-48.

［17］E.Akyilmaz，M.Turemis and I.Yasa.Voltammetric determination of epinephrine by White rot fungi (Phanerochaete chrysosporium ME446) cells based microbial biosensor[J].Biosens Bioelectron，2011，26(5)：2590-2594.

［18］Z.Chen，M.Lu，D.Zou，et al.An E.coli SOS-EGFP biosensor for fast and sensitive detection of DNA damaging agents [J].J Environ Sci.(China)，2012，24(3)：541-549.