不同產區與采收期黃柏中小檗堿與黃柏堿含量對比研究

李躍輝 胡薏冰 王 銀 彭 宇 秦裕輝 黃慧勇 張水寒

1.湖南省中醫藥研究院 楊永華名老中醫藥專家傳承工作室，湖南長沙 410006；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙 410208

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，是臨床常用的清熱燥濕藥，主治濕熱瀉痢、黃疸、熱淋、濕疹癥。黃柏習稱“川黃柏”，分布于湖北、湖南西北部、云南、四川東部等地[1]，小檗堿、黃柏堿等是其主要藥效成分，具有抗菌、消炎等藥理作用[2-3]。目前，中藥材市場存在問題較多，黃柏同種藥材或飲片質量參次不齊，區域差異、種植的規范化及不按規律采收與加工炮制等[4]均在一定程度上影響藥材的有效成分含量。試驗收集了四川、云南、貴州、湖南等地不同時間采收的22批次黃柏藥材，采用高效液相色譜（HPLC）法對其小檗堿、黃柏堿含量進行了檢測[5]，以期為黃柏藥材質量評價與資源合理利用提供試驗數據與參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；Lichrospher C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司）；KQ3200型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；T-214分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

藥材分別采集于四川、云南、貴州等地產區，具體采收與來源見表1。黃皮樹，經鑒定均為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮；小檗堿對照品（批號：110713-200911，供含量測定用）、鹽酸黃柏堿對照品（批號：111895-201202，供含量測定用）均為中國藥品生物制品檢定所提供；水為重蒸餾水，乙腈、磷酸等試劑均為色譜純，其他試劑為分析純。

表1 黃柏來源與采收時間表

2 方法與結果

2.1 小檗堿含量測定[6-8]

2.1.1 色譜條件 采用Lichrospher C18柱色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（含0.1%十二烷基磺酸鈉），檢測波長為265 nm，流速為1 mL/min，柱溫為35℃。

2.1.2 對照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加流動相配制成每毫升含100 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 各批樣品粉碎過三號篩，取約0.1 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加流動相90 mL，超聲提取（功率 250 W，頻率 40 kHz）40 min，放冷，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 系統適用性試驗 分別取上述溶液各10 μL，在上述色譜條件下進樣分析，理論塔板數按鹽酸小檗堿峰計算不低于4000，小檗堿色譜峰與相鄰峰之間分離度大于1.5。見圖1。

2.1.5 線性關系 精密吸取上述對照品溶液2.5、5、10、7.5、15、20 μL 依次進樣，按上述色譜條件測定，以進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程：Y＝41 604X-11 549，r＝0.9995。 線性范圍為 0.25～2.00 μg。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續進樣6次，記錄峰面積積分值。結果RSD為1.28%，精密度＜2%。

2.1.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，精密吸取10 μL，分別于 0、3、6、9、12、15 h 進行測定， 記錄峰面積，結果供試品溶液在15 h峰面積積分值基本穩定。

2.1.8 重復性試驗 取同批次樣品6份，按上述條件測定，結果藥材中小檗堿平均含量為7.15%，RSD值為1.89%，表明本方法重復性好。

2.1.9 回收率試驗 采用加樣回收法。取已知小檗堿含量（7.15%）的黃柏藥材6份，每份0.05 g，分別精密加入鹽酸小檗堿對照品3.5 mg，按上述含量測定項下的方法測定，結果平均回收率為97.46%，RSD值為2.03%。

2.2 黃柏堿含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Lichrospher C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）， 流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液 （含0.2%十二烷基磺酸鈉）（36∶64），檢測波長為 284 nm，流速為1 mL/min，柱溫為35℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 取鹽酸黃柏堿對照品適量，精密稱定，加流動相制成每毫升含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取各批次樣品粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入流動相25 mL，稱定重量，超聲提取（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再精密稱重，用流動相補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 系統適用性試驗 分別取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，在上述色譜條件下進樣分析，理論塔板數按鹽酸黃柏堿峰計算不低于6000，鹽酸黃柏堿色譜峰與相鄰峰之間分離度大于1.5。見圖2。

2.2.5 線性關系 精密吸取上述對照品溶液2.5、5、10、7.5、15、20 μL 依次進樣，按上述色譜條件測定，以濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程：Y＝119 128X+31 320，r＝0.9999， 黃柏堿在0.2625～2.1000 μg范圍內線性關系良好。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續進樣6次，測定峰面積積分值。結果其峰面積積分值RSD為1.28%，符合要求。

2.2.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，精密吸取10 μL，分別于 0、3、6、9、12、15 h 進行測定，記錄峰面積。 結果表明，黃柏堿在15 h內測定結果穩定。

2.2.8 重復性試驗 取同批次樣品，精密稱取6份，按上述條件測定，結果藥材中黃柏堿平均含量為0.64%，RSD值為1.76%，表明本方法重復性好。

2.2.9 回收率試驗 采用加樣回收法。取已知黃柏堿含量（0.64%）的黃柏藥材6份，每份0.25 g，分別精密加入鹽酸黃柏堿對照品1.6 mg，按上述含量測定項下的方法測定，結果平均回收率為96.89%，RSD值為2.25%。

2.3 樣品測定

取各產地及各采收期樣品，按照上述方法依次測定其小檗堿、黃柏堿的含量，結果見表2、3。

表2 不同產地黃柏藥材中小檗堿、黃柏堿含量測定結果

表3 不同采收期黃柏藥材中小檗堿、黃柏堿含量測定結果

3 討論

3.1 樣品采集

黃皮樹有雌株與雄株之分，兩者含量有一定的區別；另有報道黃柏藥材于5～13年生黃皮樹采收，以8～10年為最高，并以5月采收為最佳[9-10]。同時，黃柏采收有根皮、干皮、枝皮的區別，常規采用干皮入藥[11]。為減小客觀條件對小檗堿與黃柏堿含量的影響，本次樣品采集均選擇8年生黃皮樹雌株干皮進行試驗。

3.2 產地對含量的影響

試驗研究結果表明，采收的10個產區黃柏藥材其小檗堿與黃柏堿含量均達到了《中國藥典》2010年版含量限度要求，不同產區含量有一定的差異，試驗所收集的樣品中，以湖南保靖縣與花壇縣為最高，四川滎經縣與武隆縣也較高，說明其含量高低與地域、栽培條件有一定的關系。文獻報道，黃柏中小檗堿與黃柏堿含量多以四川地區產含量較高，也有報道貴州產含量較高[12]，此次試驗研究中，以湖南產樣品含量最高，產區保靖縣夯沙鄉與花壇縣道二鄉為新的黃柏種植基地，可能與當地環境氣候及現代種植技術提高有關。

3.3 采收期對含量的影響

從不同采收期試驗結果可看出，以小檗堿為考察指標，武隆縣與保靖縣黃柏藥材含量均以5～6月上旬為最高，6月下旬含量開始下降，7、8月含量最低，9月份含量回升；以黃柏堿含量為考察指標，5～6月上旬為最高，7、8月含量稍低，相對基本穩定。說明黃柏宜在5～6月上旬采收為宜，此時小檗堿與黃柏堿含量均最高。本次試驗收集批次樣品有限，所測數據為各產區黃柏藥材含量提供了參考，同時也為黃柏藥材資源的合理利用提供了一定依據。

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