水分和鉛雙重脅迫對紫穗槐苗木葉片抗氧化酶活性的影響

伍 歡， 王進鑫， 張 青， 劉俊峰， 鄒 朋

(西北農林科技大學 資源環境學院， 農業部 西北植物營養與農業環境重點實驗室， 陜西 楊凌 712100)

隨著經濟社會的發展和氣候的變化，水資源短缺已成為全球性的生態問題。中國的干旱、半干旱、亞濕潤干旱地區的總面積為3.32×104km2，占國土總面積的34.6%[1]，主要分布在西北地區，西北干旱地區的鉛鋅礦石的儲量很大[2]，礦產的開采及加工對環境造成了極大破壞。鉛是一種不可降解的污染物，它不僅會影響植物和農作物的生長，而且可以通過食物鏈進入人體，對人的健康造成威脅。近年來，利用植物修復重金屬污染土壤的研究逐漸增多，大多數學者[3-5]對鉛富集植物和鉛對植物生理生化特性影響的研究主要集中在生長周期較短的農作物和一年生草本植物上，有關鉛對木本植物生理生化特性影響的研究較少。木本植物較草本植物而言，具有生物量大、生長周期長和便于管理等優勢，在重金屬污染土壤的修復方面具有很大潛力。目前相關的研究中缺乏針對西北鉛鋅礦區普遍存在的干旱和重金屬鉛雙重脅迫問題的研究。

為此，本研究選取中國西北干旱地區廣泛種植的耐旱性較強的木本植物紫穗槐(AmorphafruticosaL.)，研究紫穗槐苗木對干旱和鉛雙重脅迫的生理生化響應機制，闡明紫穗槐苗木對逆境的抗性和適應能力，這對木本植物資源開發以及干旱區礦業廢棄地植被恢復和重建具有重要的理論與實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試苗木為一年生的紫穗槐(AmorphafruticosaL.)，采自陜西省楊凌區附近的苗圃。起苗前對圃地苗木進行調查，選用地徑、株高和長勢基本一致的苗木。供試苗木平均苗高74.9±6.3 cm，平均地徑11.2±1.8 mm，苗齡為1 a。栽培基質為塿土，質地為重壤，田間持水量22.3%，土壤pH值8.24，土壤有機質含量13.70 g/kg，全氮含量0.73 g/kg，速效磷含量35.91 mg/kg，速效鉀含量96.52 mg/kg，土壤鉛背景值16.3±2.96 mg/kg[6]。2011年12月，向土樣中加入99%的分析Pb(CH3COO)2·3H2O，充分混勻后鈍化2個月，以作備用。

1.2 試驗方法

試驗地布設于陜西省楊凌區西北農林科技大學主校區人工旱棚內。試驗采用完全隨機區組設計，共設4個水分處理水平和5個鉛處理水平，共20個處理(表1)，每處理重復3次。4個水分處理水平分別為：土壤相對含水量(SWRC)100%(CK)，80%(輕微水分脅迫)，60%(輕度水分脅迫)和40%(重度水分脅迫)[7-9]。5個鉛處理水平分別為：0，1 000，2 000，4 000和6 000 mg/kg。2012年3月，將鈍化后的土樣盛入高30 cm，口徑27 cm的塑料容器中，按0—30 cm平均土壤容重1.15 g/cm3裝土,保證各容器中干土重一致。并將苗木移栽至容器，每容器1株紫穗槐，移栽前清洗苗木根部附著土壤。在紫穗槐苗木生長期間，采用稱重法控制土壤相對含水量，每3 d稱量1次，以便及時調整每日補充灌水量，同時，所有容器土表面覆蓋厚約2 cm的砂石以減少水分蒸發。試驗期間不施肥，使栽培基質保持自然肥力。

表1 試驗處理及處理代碼

1.3 測定項目及方法

酶液的制備：于2012年5月18日上午采集紫穗槐葉片，每株均取新梢中部的成熟葉片，將采集后的葉片編號并置于4 ℃冷藏保存。每處理取0.5 g鮮葉片于預冷的研缽中，加入0.05 mol/L的冷磷酸緩沖液(pH值7.8)5 ml和少量石英砂，冰浴研磨。至勻漿后用0.05 mol/L的冷磷酸緩沖液(pH值7.8)5 ml沖洗，并轉移至離心管。10 000 rpm 4 ℃離心15 min，上清液即為酶提取液，將酶液轉移至試管，4 ℃冷藏保存，作為備用。

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)法[10]測定，取酶液0.2 ml于試管中，加入核黃素、Met溶液、NBT溶液、EDTA—Na2溶液和蒸餾水，混勻后置于4 000 lx日光下反應20 min；另設兩支以0.2 ml蒸餾水代替酶液的對照管，用黑色硬紙遮光。至反應結束后，用黑布遮蓋試管，以終止反應。反應終止后于560 nm下測光密度(OD)值。SOD以抑制50% NBT發生光化學還原為1個酶活性單位。過氧化物酶(POD)采用愈創木酚顯色法[10]測定，取0.2 ml的酶液加入愈創木酚、蒸餾水和雙氧水搖勻反應，最后以偏磷酸終止反應，在470 nm下測OD值。POD以每1 min氧化1 μmol愈創木酚為1個酶活單位。過氧化氫酶(CAT)活性采用H紫外分光光度法測定[11]，每1 min記錄1次，以1 min內OD 240值降低0.1為1個酶活單位。計算酶活性時葉片重量均以鮮重計。

1.4 數據處理

使用SPSS 18.0進行數據統計分析，并用Duncan法進行平均值之間的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 水分和鉛雙重脅迫對紫穗槐苗木葉片SOD活性的影響

植物細胞在正常代謝過程中和在環境脅迫下均能產生活性氧和自由基，SOD是活性氧清除反應過程中第一個發揮作用的抗氧化酶[12]，SOD活性的增加表明植物細胞清除超氧自由基的能力增強，植物的抗逆性也隨之增強。試驗結果(表2)表明，在單一鉛脅迫處理下，隨著鉛脅迫的加劇，紫穗槐苗木葉片的SOD活性呈先升高后降低的趨勢，且都顯著高于對照(CK)處理(p<0.05)，C處理(鉛含量為4 000 mg/kg)SOD活性達到最大值，為對照的124.06%；在單一水分脅迫處理下，SOD活性呈先升高后降低的趨勢，T1，T2處理均顯著高于對照處理(p<0.05)，T2處理(60% SWRC)SOD活性達到最大值，為對照的122.62%；表明單一的水分或鉛脅迫對紫穗槐苗木葉片的SOD活性有激活作用。在水分和鉛雙重脅迫處理下，SOD活性的變化比較復雜，但都顯著高于對照(p<0.05)，說明雙重脅迫對紫穗槐苗木葉片的SOD活性有一定的激活作用。雙重脅迫處理下，A處理組(鉛含量為1 000 mg/kg)，B 處理組(鉛含量為2 000 mg/kg)和C處理組(鉛含量為4 000 mg/kg)中，SOD活性均低于相應的單一鉛脅迫處理(A,B,C處理)，說明此時水分脅迫和鉛脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片的SOD活性的誘導表現為拮抗作用；D處理組(鉛含量為6 000 mg/kg)中，雙重脅迫下SOD活性均高于相應的單一鉛脅迫處理(D處理)，說明此時水分脅迫和鉛脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片的SOD活性的誘導表現為協同作用。在雙重脅迫處理下，SOD活性在AT1處理達到最大值，為對照處理的117.58%，且明顯高于對照處理(p<0.01)；在DT2處理達到最小值，為對照的105.76%。

表2 水分和鉛雙重脅迫處理下紫穗槐苗木葉片的SOD活性 U/g

2.2 水分和鉛雙重脅迫對紫穗槐苗木葉片POD活性的影響

POD在生物體內的抗氧化代謝中具有關鍵作用，它主要清除氧代謝中產生的H2O2以及由此產生的過氧化物ROOH[13]，從而保護細胞。試驗結果(表3)表明，在單一鉛脅迫處理下，POD活性隨脅迫的加劇而呈升高趨勢，在D處理達到最大值，為對照的145.93%，但A，B處理與對照處理差異不顯著(p>0.05)，說明POD活性對低含量的鉛(≤2 000 mg/kg)脅迫不敏感；在單一水分脅迫處理下，POD活性隨脅迫的加劇呈先升高后降低的趨勢，且都明顯高于對照處理(p<0.01)，說明POD活性對水分脅迫較敏感，POD活性在T2處理達到最大值，為對照處理的165.41%。在雙重脅迫處理下，POD活性在AT3處理達到最大值，為對照的216.28%，在DT3處理達到最小值，為對照的101.45%。A處理組(鉛含量為1 000 mg/kg)和B處理組(鉛含量為2 000 mg/kg)中，在輕度水分脅迫(60% SWRC)和重度水分脅迫(40% SWRC)處理下POD活性均明顯高于相應的單一鉛脅迫處理(p<0.01)，說明此時水分脅迫和鉛脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片POD活性的誘導表現為協同作用；C處理組(鉛含量為4 000 mg/kg)和D處理組(鉛含量為6 000 mg/kg)中，除DT3處理的POD活性明顯低于相應的單一鉛脅迫處理(D)外(p<0.01)，其他雙重脅迫處理的POD活性與相應的單一鉛脅迫處理差異不顯著(p>0.05)，說明此時水分脅迫和鉛分脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片的POD的活性的誘導沒有顯著影響，C處理組中POD活性高于相應的單一鉛脅迫處理而D處理組中POD的活性均低于相應的單一鉛脅迫處理，可能是由于高含量的鉛(6 000 mg/kg)和水分雙重脅迫對POD本身的酶蛋白結構造成了破壞。

2.3 水分和鉛雙重脅迫對紫穗槐苗木葉片CAT活性的影響

CAT廣泛存在于各種植物組織中，其主要功能是催化細胞內多余的H2O2分解，使細胞內的H2O2維持在正常水平，從而使植物細胞免遭毒害，其活性的高低與植物的抗逆性有一定關聯[4,14]。試驗結果(表4)表明，在單一鉛脅迫處理下，CAT活性隨脅迫的加劇呈先升高后降低的趨勢，A,B,C處理的CAT活性均明顯高于對照(p<0.01)，在B處理達到最大值，為對照的189.50%，D處理的CAT活性均明顯低于對照(p<0.01)，為對照的26.20%，說明紫穗槐苗木葉片的CAT活性對鉛脅迫較敏感；在單一水分脅迫處理下，CAT活性隨脅迫的加劇呈先降低后升高的趨勢，且都明顯高于對照(p<0.01)，說明水分脅迫對紫穗槐苗木葉片的CAT活性有激活作用。在雙重脅迫處理下，各處理(除AT3處理外)的CAT活性均明顯低于相應的單一水分脅迫處理(p<0.01)，說明水分脅迫和鉛脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片的CAT活性的誘導表現為拮抗作用；當鉛含量較低(≤2 000 mg/kg)時，各處理(除BT1處理外)的CAT活性均高于對照，說明此時雙重脅迫對CAT活性有激活作用；當鉛含量較高(>2 000 mg/kg)時，各處理(除CT1處理外)的CAT活性均明顯低于對照(p<0.01)，說明此時雙重脅迫對CAT活性有抑制作用。

表3 水分和鉛雙重脅迫處理下紫穗槐苗木葉片的POD活性 U/(g·min)

表4 水分和鉛雙重脅迫處理下紫穗槐苗木葉片的CAT活性 U/(g·min)

3 討 論

植物在正常生長情況下，體內活性氧的產生和清除處于平衡狀態，但在受到逆境脅迫時，植物細胞會產生過量的活性氧自由基，對細胞造成傷害[15]，植物經過長期的進化，自身已形成一套保護性酶系統，其中SOD，POD和CAT是植物體內重要的保護性酶，它們對于清除細胞內過量的活性氧、維持細胞的健康和穩定具有重要作用。因此，保護性酶活性的高低在一定程度上反映了植物對逆境的耐受能力。

本研究中，在單一的鉛脅迫處理下，隨著脅迫的加劇，紫穗槐苗木葉片的SOD和CAT活性均呈現先升高后降低的趨勢，而POD活性一直呈現升高趨勢，金琎等[16]對小麥保護酶系統的研究結果與此一致；紫穗槐苗木葉片的SOD活性和CAT活性對鉛脅迫較敏感，而POD活性對低含量的鉛(≤2 000 mg/kg)脅迫不敏感，陳麗娜等[17]對花芽甜麥菜的研究結果與此一致。這說明在鉛脅迫處理下，紫穗槐苗木葉片的SOD和CAT活性變化較POD活性而言更加迅速，是較敏感的生物指標，但在高含量的鉛(≥2 000 mg/kg)脅迫處理下，SOD和CAT活性受到一定程度的抑制，而POD始終維持較高的活性、清除活性氧的能力不斷增加，表明POD在紫穗槐苗木抵抗高含量的鉛(≥2 000 mg/kg)污染中發揮了主要作用。

在單一的水分脅迫處理下，隨著脅迫的加劇，紫穗槐苗木葉片的SOD和POD活性均呈先升高后降低的趨勢，而CAT活性呈先降低后升高的趨勢，王霞等[18]對8種檉柳的研究和孫國榮等[19]對白樺實生苗的研究結果與此一致。這說明在水分脅迫下，紫穗槐苗木葉片的SOD和POD的調節能力是有限的，當脅迫超過一定限度后，細胞會因為受損而導致酶活性下降，這與植物一般的應激規律相符[20]，同時說明了水分脅迫破壞了紫穗槐保護酶系統的動態平衡，并且在水分脅迫下SOD，POD和CAT是相互協調從而起到調節作用的。

水分和鉛雙重脅迫下紫穗槐苗木葉片的SOD，POD和CAT活性的變化比較復雜。當鉛含量小于6 000 mg/kg時，水分脅迫和鉛分脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片的SOD活性的誘導表現為拮抗作用，對POD活性的誘導表現為協同作用(除AT1處理外)；當鉛含量為6 000 mg/kg時，水分脅迫和鉛脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片的SOD活性的誘導表現為協同作用，對POD活性的誘導表現為抑制作用；水分脅迫和鉛脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片的CAT活性的誘導表現為拮抗作用(除AT3處理外)。雙重脅迫對紫穗槐苗木葉片的SOD和POD活性有顯著的激活作用(除AT1和DT3處理的POD活性與對照差異不顯著外)，對低鉛含量(≤2 000 mg/kg)處理的CAT活性有激活作用(除BT1處理外)，對高鉛含量(>2 000 mg/kg)處理的CAT活性有抑制作用(除CT1處理外)。說明雙重脅迫誘導了SOD和POD的活性，并且在低鉛含量(≤2 000 mg/kg)處理下也誘導了CAT活性，使紫穗槐苗木在雙重脅迫的逆境下產生一個強于正常條件的抗氧化酶系統，從而保護細胞，而高鉛含量(>2 000 mg/kg)下CAT活性的降低有可能是由于雙重脅迫導致了CAT本身酶蛋白結構的破壞，這也說明了紫穗槐在雙重脅迫下具有較好的自我保護和調節能力，并且適度的雙重脅迫(鉛含量≤2 000 mg/kg，土壤相對含水量≥40%)有利于提高紫穗槐苗木對水分和鉛雙重脅迫的耐受性。

4 結 論

在水分和鉛雙重脅迫下，紫穗槐苗木葉片的SOD，POD和CAT活性的變化表明紫穗槐苗木對雙重脅迫具有良好的適應能力和調節能力，并且適度的雙重脅迫(鉛含量≤2 000 mg/kg，土壤相對含水量≥40%)有利于提高紫穗槐苗木對水分和鉛雙重脅迫的耐受性。同時，由于紫穗槐生物量大，生長周期長，根、莖、葉發達，具有草本植物無法比擬的優勢，因此，紫穗槐具備種植于干旱、半干旱地區礦業廢棄地及鉛污染土壤上的潛力。本研究僅對水分和鉛雙重脅迫下，紫穗槐苗木生長初期葉片的抗氧化酶活性變化進行了初步探討，其他生長階段內葉片的抗氧化酶活性變化及其機理還有待進一步研究。

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