DKK-1、GSK-3β、PGSK-3β在宮頸鱗癌組織中的表達及臨床意義

黃 裕 姜青明 唐 郢 王 冬

宮頸癌的發生是多因素、多步驟的過程，多種因素和多個信號轉導途徑在其發生、發展過程中發揮作用，細胞信號傳導通路具有重要調節作用，信號傳導異常可能引起分化異常甚至惡化。DKK-1(Dickkopf-1)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β)、磷酸化的GSK-3β(PGSK-3β)均是參與Wnt腫瘤信號通路的重要成分，本研究采用免疫組織化學方法測定三者在不同宮頸組織中的表達，并結合臨床病理因素，分析它們在宮頸鱗癌發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

收集2010年1月至2013年5月間在我院門診活檢或手術治療的95例正?；虿∽儗m頸組織標本，所有患者術前均未接受放化療。其中慢性宮頸炎25例，宮頸上皮內瘤變(CIN)29例，宮頸鱗癌41例，年齡29～72歲，平均(45.5±6.7)歲。同時記錄宮頸鱗癌患者臨床分期、腫瘤大小、淋巴結轉移及組織分化等臨床病理資料。

1.2 試劑和儀器

濃縮型兔抗人DKK-1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗人GSK-3β多克隆抗體和兔抗人PGSK-3β多克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，濃縮型DAB顯色試劑盒(北京中山生物技術有限公司)，SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，光學顯微鏡和Olympus DP70圖像采集系統(日本Olympus公司)。

1.3 實驗方法

取宮頸組織的石蠟包埋標本，制成4 μm厚度連續切片，采用免疫組織化學染色檢測其中DKK-1、GSK-3β、PGSK-3β的表達。高壓鍋法修復抗原，加入適當稀釋的一抗(DKK-1稀釋度為1∶100，GSK-3β和PGSK-3β稀釋度為1∶50)，滴加試劑SABC室溫孵育30 min，使用DAB試劑盒進行顯色。

1.4 結果判定

依據染色細胞比例和染色強度進行綜合評分。在高倍光鏡下(×200)挑選5個視野，每個視野計數200個細胞。陽性標準為細胞核和(或)細胞質著色。染色細胞比例的積分標準為：陽性細胞數<10%為0分，10%～19%為1分，20%～50%為2分，>50%為3分。染色強度積分標準為：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將染色細胞比例和染色強度兩項積分相乘，總分為0～2分為陰性表達，3～9分為陽性表達。應用Image-pro5.0圖像分析軟件計算陽性細胞平均光密度。

1.5 統計學處理

數據均應用SPSS 16.0軟件進行處理，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DKK-1、GSK-3β、PGSK-3β在宮頸組織中的表達

DKK-1陽性表達主要定位于細胞質中，慢性宮頸炎組織中其陽性表達率為84.0%，從癌前病變發展至癌，DKK-1陽性表達率逐漸降低。慢性宮頸炎、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ～Ⅲ組織中DKK-1陽性表達率均明顯高于宮頸癌(P均<0.05)。GSK-3β陽性表達主要定位于細胞核中，慢性宮頸炎組織中GSK-3β陽性表達率明顯高于宮頸癌(P<0.05)。PGSK-3β陽性表達主要定位于細胞質中，慢性宮頸炎組織中PGSK-3β陽性表達率明顯低于宮頸癌(P<0.05)，見表1。

表1 DKK-1、GSK-3β、PGSK-3β在各宮頸組織中的表達(例，%)

a為與宮頸癌比較，P<0.05。

2.2 各宮頸組織中GSK-3β和PGSK-3β陽性顆粒平均光密度

GSK-3β蛋白表達在宮頸癌組織中的表達量最高。PGSK-3β蛋白在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ-Ⅲ及宮頸癌組織中的表達量明顯高于慢性宮頸炎，差異具有統計學意義(P<0.05)；CIN Ⅰ中PGSK-3β蛋白表達量最高，與宮頸癌組織比較差異顯著(P<0.05)，但隨著病情的發展逐漸呈下降趨勢，見表2。

表2 各宮頸組織中GSK-3β和PGSK-3β陽性顆粒平均光密度

注：a為與宮頸癌比較，P<0.05；b為與慢性宮頸炎比較，P<0.05。

2.3 DKK-1及PGSK-3β表達與宮頸鱗癌臨床病理特征的關系

DKK-1陽性表達率與宮頸鱗癌組織分化、FIGO臨床分期及有無淋巴結轉移顯著相關(P<0.05)；而與患者年齡、肌層浸潤程度無相關性(P>0.05)；PGSK-3β陽性表達率與宮頸鱗癌組織分化、FIGO臨床分期及有無淋巴結轉移顯著相關(P<0.05)；與患者年齡、肌層浸潤程度無相關性(P>0.05)，見表3。

表3 DKK-1、PGSK-3β表達與宮頸鱗癌臨床病理特征的關系(例，%)

3 討論

DKK-1是1個分泌型糖蛋白，屬于DKK家族成員，是1種有力的Wnt信號途徑拮抗劑。DKK-1通過誘導形成1種三元復合物，產生內吞作用，發揮抑制功能，造成Wnt經典信號傳導途徑阻斷，從而誘導體內多種腫瘤細胞發生凋亡[1-3]。DKK-1在宮頸癌的發生、發展中具有重要作用，在宮頸癌細胞株Hela中DKK-1表達沉默，從Hela細胞株培養分離出的非致瘤性回復突變株中DKK-1高表達[4]。崔素芬等[5]對36例宮頸癌組織標本進行DKK-1陽性表達檢測，結果顯示DKK-1陽性表達呈現明顯下調。本研究中DKK-1在宮頸組織中陽性表達主要定位于細胞質中，慢性宮頸炎、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ～Ⅲ、DKK-1陽性表達率均明顯高于宮頸鱗癌中的陽性表達率(P<0.05)。從慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變發展至宮頸浸潤鱗癌，DKK-1的陽性表達率依次降低，提示DKK-1表達沉默在宮頸癌發生中存在重要作用，與文獻報道的研究結果相一致。研究DKK-1表達下調機制發現宮頸癌Hela細胞的致瘤性生長過程中需要關閉DKK-1基因，有異常甲基化出現于Hela細胞內的DKK-1基因啟動子區，可能與組蛋白降解也存在相關性[6]。本研究還發現，DKK-1的陽性表達率在不同年齡、肌層浸潤分組間表達差異無統計學意義(P>0.05)，在不同組織分化、臨床分期及有無淋巴結轉移分組間表達差異顯著(P<0.05)，提示DKK-1陽性表達高低可能有助于判定宮頸浸潤癌的預后。

GSK-3β作為1種多功能絲/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛參與細胞周期、細胞骨架的穩定和基因表達等細胞基本功能的調節，PGSK-3β是磷酸化氮端9位絲氨酸后的GSK-3β失活形式，在腫瘤發生、發展、轉移、耐藥等密切相關信號轉導通路中發揮重要調節作用，是一個重要腫瘤相關因子。GSK-3β在皮膚癌、乳腺癌、卵巢癌、結腸癌等上皮性腫瘤中均出現異常表達[7-8]，本研究顯示PGSK-3β的陽性表達率在不同組織分化、FIGO臨床分期及有無淋巴結轉移分組間表達差異具有統計學意義(P<0.05)，提示PGSK-3β表達可能是宮頸癌預后不良的獨立危險因素。另外研究還發現GSK-3β在宮頸組織中陽性表達主要定位于細胞核，從慢性宮頸炎、CIN發展為宮頸浸潤癌的過程中，GSK-3β陽性顆粒平均光密度呈逐漸下降趨勢，但在宮頸癌組織中表達最高。而PGSK-3β在宮頸組織中陽性表達主要定位于細胞質中，在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ～Ⅲ及宮頸鱗癌組織中的蛋白表達量明顯高于慢性宮頸炎(P<0.05)；PGSK-3β在CIN Ⅰ時的蛋白表達量最高，與宮頸癌比較差異顯著(P<0.05)，并隨著病程的發展逐漸呈下降趨勢。GSK-3β在慢性宮頸炎組織中保持較高的表達水平，有著較強的激酶活性，而PGSK-3β磷酸化蛋白在癌組織中的高水平表達，說明GSK-3β的激酶活性被明顯抑制。

值得關注的是，GSK-3β在腫瘤發生中具有矛盾的兩面性，不少抑制GSK-3β表達的實驗研究表明GSK-3β具有促進腫瘤發生的作用[9-10]。PGSK-3β作為失活形式并不直接表明GSK-3β的活性程度，因此盡管DKK-1、GSK-3β、PGSK-3β陽性表達預示了宮頸癌患者的不良預后，但具體作用機制尚待進一步研究。

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