CIK聯合DDP對卵巢癌細胞株SKOV-3的殺傷效應

徐 梅 張 蓓 尹鳳玲 成 杰 劉 洋 李 丹 蔣敬庭 吳昌平

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一，其組織類型繁多，約85%～90%為上皮性卵巢癌。隨著免疫細胞生物學、免疫學、分子生物學的飛速發展，免疫治療(特別是細胞過繼性免疫治療)已成為繼腫瘤患者手術、化療、放療后輔助治療的重要手段之一[1]。本研究目的是探討CIK細胞是否增強化療藥順鉑DDP對卵巢癌細胞株SKOV-3的殺傷活性，為卵巢癌綜合治療新策略提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

①淋巴細胞分離液(中國醫學科學院血液研究所)；②COBE spectra 型血細胞分離機(Gambro BC公司)；③流式細胞分析儀EPICS XL(美國貝克曼庫爾特公司)；④鼠抗人CD3McAb(美國Antihody Diagnostica Inc公司)；⑤基因重組人IL-2(山東泉港藥業有限公司)；⑥重組人IFN-γ(上海克隆生物高技術有限公司)；⑦重組人IL-1α(美國Pepro Tech EC Ltd公司)；⑧鼠抗人CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE三標記抗體，CD3-FITC/CD16CD56-PE雙標記抗體，同型對照IgG1FITC/IgG1PE/IgG1PE-Cy5IgG1FITC/IgG1PE，IgG1

-PE，IgG1-PC5：(美國Beckman Coulter公司，蘇醫生物基因公司)；⑨ANNEXIN V-FITC凋亡檢測試劑盒(碧云天生物公司)；⑩順鉑注射液(批號：130302 江蘇豪森藥業股份有限公司)。

1.2 效應CIK細胞的制備和免疫表型分析[2]

用淋巴細胞分離液密度離心提取O型健康者單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，用RPMI-1640完全培養液調整細胞濃度至2×106/ml，第1天加入IFN-γ(1.5×106U/L)，置入37℃、5%CO2培養箱中，24 h后加入CD3 McAb (100 μg/L)、IL-2(5.0×105U/L )和IL-1α(1.0×105U/L)，以后每2～3天添加一次培養液，同時補加IL-2(5.0×105U/L)，于培養第1、7、14天收取CIK細胞，分別加入抗CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE三標抗體和抗CD3-FITC/CD56-PE雙標抗體混勻，4℃避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測CIK細胞表型變化，測定CD3+CD56+雙陽性細胞百分比。

1.3 卵巢癌細胞株的培養

SKOV-3細胞株購自上海中國科學院細胞庫，凍存于-196℃液氮中，由我院中心實驗室傳代培養，培養于改良RPMI-1640完全培養基。

1.4 流式細胞儀檢測CIK培養上清液對SKOV-3細胞的凋亡作用

選取培養l4天的CIK細胞，更換培養液，培養48 h后，1 500r/min，離心5 min，留取CIK細胞培養的上清液，以1∶1的比例混合新鮮改良RPMI-1640培養液培養SKOV-3細胞，培養24 h、48 h收集細胞，以未加CIK培養液上清的SKOV-3細胞作為對照組。按照Annexin V-FITC試劑盒說明結合流式細胞儀檢測凋亡情況。

1.5 MTT法測定CIK細胞和DDP對SKOV-3細胞的殺傷效應

取培養第14天收獲的CIK細胞作為效應細胞，對數生長期的SKOV-3細胞作為靶細胞。調整靶細胞濃度為1.0×105/ml，加入96孔平底培養板，100 μl/孔。次日細胞貼壁后按不同組別給予相應處理：A1～4CIK作用組，按效靶比不同(A1組5∶1、A2組10∶1、A3組20∶1、A4組40∶1)加入不同濃度的CIK細胞100 μl；B1～7DDP作用組分別加入用完全培養基配制的不同濃度DDP100 μl (其作用濃度分別為：B1組0.625、B2組1.25、B3組2.5、B4組5、B5組10、B6組20、B7組40 μg/ml)；C1～2CIK聯合DDP作用組先給予DDP(濃度2.5 μg/ml)作用4 h后，分別按效靶比為5∶1和10∶1加入不同濃度CIK細胞。同時設單獨靶細胞及不同濃度效應細胞做對照孔，每組設6個復孔，置于37 ℃、5%CO2孵箱中分別于培養24 h、48 h后，每孔加MTT 20 μl (5 mg/ml)，繼續培養4 h，平板離心機1 500 r/min離心10 min，小心棄去上清液，每孔再加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μl，輕輕振蕩10 min以溶解形成的色素顆粒，用酶聯免疫檢測儀檢測λ=492 nm波長處的吸光度(A值)。按下列公式計算抑制率：抑制率 (%)=[1-(實驗孔A值-效應細胞A值)/靶細胞A值]×100%或抑制率(%)= (1-實驗孔A值/靶細胞A值)×100%

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 CIK細胞表型分析和擴增[2]

CD3+CD56+雙陽性CIK細胞在第1、7、14天所占比例分別為(0.7±0.4)%、(11.5±0.9)%及(31.6±5.5)%。隨著培養時間延長，CD3+CD56+雙陽性CIK細胞表達的比例逐漸增加，本實驗選用培養第14天的CIK細胞，流式細胞儀檢測其CD3+CD56+細胞比例達38.7%，見圖1。說明CIK細胞可通過體外培養獲得大量增殖。

圖1 培養第14天CD3+CD56+CIK細胞表型變化

2.2 流式細胞儀檢測CIK培養上清液誘導SKOV-3細胞凋亡情況

Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色后，正常的活細胞不會被染色(FITC-/PI-，圖2左下象限)，凋亡早期的細胞僅被Annexin V-FITC染色(FITC+/PI-，圖2右下象限)，凋亡晚期和壞死細胞會被Annexin V-FITC和PI雙染(FITC+/ PI+，圖2右上象限)。本實驗組24 h 及48 h凋亡率分別為(12.63±0.95)%和(27.13±2.03)%，其差異有統計學意義(P<0.01)。表明在一定時間內，隨著作用時間的延長凋亡率不斷增高。

圖2 SKOV-3細胞與CIK培養上清液共培養后凋亡情況

2.3 MTT法檢測不同因素對SKOV-3生長抑制情況見

在相同作用時間時，CIK、DDP及其聯合治療各小組間抑制率存在顯著性差異(P<0.05)，除DDP 0.625 μg/ml組24 h和48 h抑制率差異無顯著性(P=0.102)，其余各組不同時間抑制率存在顯著性差異 (P<0.05)，隨著作用時間延長，其細胞抑制作用明顯增強。聯合用藥組與單一因素處理組組間比較差異存在顯著性 (P<0.05)。見表1。

3 討論

CIK細胞是由Schmidt Wolf等在1991年首先報道。其是將人外周血單個核細胞(PBMC)在體外經多種細胞因子(如抗CD3McAb、IL-2、γ-IFN等)共培養后獲得的一群異質細胞群。CD3+CD56+細胞是CIK細胞中的主要效應細胞，既有T淋巴細胞強大的抑瘤活性，又具有NK細胞非MHC限制性殺瘤優點，故又稱為NK細胞樣T淋巴細胞[3-4]。CIK細胞與LAK細胞、CD3AK細胞相比具有增殖快、殺瘤活性高及對多重耐藥腫瘤細胞同樣敏感的特點[5]，被認為是新一代抗腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方法。CIK治療已被應用于腫瘤患者的臨床治療(如白血病[6]、胃癌[7]、肺癌[8]、肝癌[9]等)并取得較好的殺瘤效果。

研究結果[2]顯示，起初CD3+CD56+細胞比例為(0.7±0.4)%，第14、21天分別增為(31.6±5.5)%

表1 CIK或(聯合)DDP對SKOV-3細胞的殺傷作用

注：①A1～4CIK治療組：CIK與SKOV-3效靶比依次為5∶1、10∶1、20∶1、和40∶1；②B1～7DDP治療組：DDP濃度依次為0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μg/ml；③C1～2聯合治療組：DDP濃度均為2.5 μg/ml，CIK與SKOV-3效靶比分別為5∶1和10∶1。

和(35.8±9.7)%，擴增倍數可達35～52倍。動態分析其表型特征發現，第14～21天為CD3+CD56+細胞高表達的平臺期，在此期間可獲得較為理想的效應細胞，進一步臨床研究發現，增加CIK細胞輸注的頻次可明顯降低胃癌患者的死亡風險[7]。本實驗選擇體

外培養14天的CIK細胞，流式細胞檢測其CD3+CD56+細胞所占比例達到38.7%。殺傷實驗結果顯示，當效靶比為5∶1時，24 h和48 h的殺傷率分別為(16.52±2.52)%和(24.20±5.59)%。當效靶比增為40∶1時，其24 h和48 h的殺傷率分別為(53.98±5.02)%和(74.74±6.87)%，說明CIK細胞對SKOV-3卵巢癌細胞具有較強的殺傷作用，并且，隨著效靶比增加及作用時間延長，其細胞毒性明顯增強。順鉑是卵巢癌經典的一線化療藥物，本研究中，當順鉑濃度為2.5 μg/ml時，48 h對SKOV-3的抑制率為(46.04±2.76)%，聯合5∶1和10∶1 CIK細胞共培養48 h后細胞抑制率分別為(69.87±2.67)%和(80.11±2.73)%。這說明隨著CIK細胞濃度的增加及作用時間的延長，細胞抑制率明顯增高。常規化療聯合CIK治療具有協同抗腫瘤效應。

CIK細胞對腫瘤細胞發揮殺傷作用的機制可能有以下幾點：①與靶細胞結合并釋放穿孔素及顆粒酶對靶細胞發揮殺傷作用。②產生大量細胞因子(如γ-IFN，TNF-α，IL-2等)作用于腫瘤細胞。③調節免疫系統發揮間接殺傷作用。研究[10]發現，腫瘤患者在經過CIK細胞治療后，其外周血中CD4+CD25+調節T細胞(Treg)比例較治療前明顯降低，說明CIK治療可以在一定程度上提高患者的免疫功能。④誘導腫瘤細胞凋亡和壞死。Shan等[11]用Curcumin可提高靶細胞及CIK細胞表面Fas-FasL蛋白的表達而發揮促進凋亡作用。另有研究[12-13]發現，CIK細胞是通過下調凋亡抑制基因Bcl-2或上調促凋亡基因Bax蛋白表達來誘導腫瘤細胞凋亡。本實驗采用CIK培養液上清和SKOV-3細胞共培養，隨后24 h和48 h凋亡檢測結果顯示細胞凋亡和壞死率逐漸增加，說明CIK可產生殺傷因子并通過誘導卵巢癌SKOV-3細胞凋亡而發揮殺傷作用。

卵巢癌位于盆腔，其轉移和復發具有局限于腹腔內的特點，自體CIK 細胞無免疫源性，應該比較適合于腹腔灌注治療。CIK治療可為無法手術又難以耐受放化療的晚期卵巢癌患者提供治療策略。對延長此類患者生存期、改善其生存質量，具有非常重要的意義。

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