五味子多糖誘導裸鼠膠質瘤細胞凋亡的作用及機制

溫 娜 唐澤波 張 宇 劉興吉 金 宏 齊 玲 于洪泉

(吉林醫藥學院基礎醫學院，吉林 吉林 132013)

神經膠質瘤是顱內最常見的原發性腫瘤，以惡性居多〔1，2〕。膠質瘤一經發現，即處于晚期，很多患者不能手術，因此化療在膠質瘤治療中占極為重要的地位。五味子多糖(CPSC)就是從五味子成熟干燥果實中提取出來的，具有多種藥理活性的復合物。研究表明CPSC具有抗腫瘤活性〔3～6〕，但其抗腫瘤作用機制尚不清楚。本課題組前期研究發現CPSC可以抑制膠質瘤細胞的生長〔7〕。本文將進一步研究CPSC對體外培養裸鼠膠質瘤細胞凋亡的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑 裸鼠膠質瘤細胞本實驗室提?。籆PSC(北華大學提供)；細胞培養基RPMI1640 (Thermo公司)，小牛血清和0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，Bax、Bcl-2抗體(北京中杉公司)。

1.2提取原代裸鼠膠質瘤細胞 復蘇及培養裸鼠膠質瘤細胞，以2×106/75 cm2密度將細胞接種于培養瓶中，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養，每隔1～3 d換液1次。

1.3ELISA法測定裸鼠膠質瘤細胞培養上清中Bax和Bcl-2蛋白表達 將裸鼠腦腫瘤細胞以1×104/ml密度接種于24孔培養板中，實驗分為對照組(不含藥物)和CPSC組(200，400，800 μg/ml)，藥物作用48 h，每組設5個復孔。取細胞培養上清，將上清液與包被液按1∶1比例包被后4℃過液。封閉后加入Bax和Bcl-2抗體(1∶500稀釋)于4℃過夜。加入二抗室溫下孵育2 h，加顯色液室溫避光顯色。于自動酶標儀492 nm處測定A值，并計算Bax和Bcl-2比值。

1.4細胞免疫組織化學法檢測Bax和Bcl-2蛋白在裸鼠膠質瘤細胞陽性表達率 按上述方法和分組用不同劑量CPSC作用細胞48 h后，吸出培養上清，取出玻片，10%甲醛溶液固定30 min，滅活后一抗過夜，二抗室溫孵育2 h，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明、封片。鏡下觀察，以細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性著色，按照公式計算Bax和Bcl-2表達陽性率(陽性細胞數/總細胞數×100%)。

1.5統計學方法 應用SPSS17.0軟件，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結 果

2.1CPSC對體外培養裸鼠膠質瘤細胞上清中Bax和Bcl-2蛋白表達水平 不同濃度CPSC作用裸鼠膠質瘤細胞48 h后，與對照組(0 μg/ml)比較，其培養上清中Bcl-2蛋白表達水平均下降(P<0.01)；Bax的表達值隨CPSC濃度的增加而遞增。多糖組Bax/Bcl-2均升高，與對照組比較有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組裸鼠膠質瘤細胞培養上清中Bax和Bcl-2蛋白表達

2.2細胞免疫組織化學法檢測各組裸鼠膠質瘤細胞Bax和Bcl-2陽性表達率 CPSC作用裸鼠膠質瘤細胞48 h后，400和800 μg/ml多糖組Bax蛋白陽性表達率均明顯升高，與對照組(0 μg/ml)比較有統計學意義(P<0.01)，400和800 μg/ml多糖組Bcl-2蛋白陽性表達率均下降，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組裸鼠膠質瘤細胞Bax和Bcl-2陽性表達率(%)

3 討 論

腦膠質瘤是最常見的顱內惡性腫瘤，發病率和死亡率都很高，病程難以控制，目前治療方案仍然是手術切除輔以放療和化療等綜合治療為主。誘導或促進腫瘤細胞凋亡是治療腫瘤的基本方法之一。五味子抗腫瘤作用主要集中在木脂素和多糖部位〔4〕。其中，CPSC是其抗腫瘤的主要成分之一，其藥理研究表明，具有抑瘤〔4～6〕等作用。因此，CPSC具有預防和治療腫瘤的潛在價值。

細胞凋亡是廣泛存在于生理和病理狀態下的有序的受一系列基因嚴格控制的程序化死亡，是級聯式基因表達的結果，可以通過多種形式誘導凋亡發生。目前已發現許多與凋亡相關的基因，其中Bcl-2家族對凋亡起重要調節作用〔8〕，Bax和Bcl-2是其家族的兩個重要成員代表，其作用相互拮抗，Bax則促進細胞凋亡，Bcl-2抑制細胞凋亡。Bcl-2/Bax之間的比例是決定細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素，研究表明〔9〕，當Bcl-2蛋白表達增加時，在細胞內可形成Bcl-2/Bax異源二聚體，抑制凋亡的產生。當Bax表達加強時則形成同源二聚體Bax/Bax將加速細胞凋亡，因此，Bax和Bcl-2表達的比例對細胞的凋亡與否起決定性作用〔10〕。

本研究結果顯示CPSC可能通過上調Bax蛋白和下調Bcl-2蛋白激活線粒體信號傳導路徑，引起細胞凋亡，從而使裸鼠膠質瘤細胞發生凋亡。但其機制還需進一步深入研究。

4 參考文獻

1徐俊杰，于洪泉，趙 偉，等.西蘭花多肽對C6膠質瘤細胞的誘導凋亡作用〔J〕.吉林大學學報(醫學版)，2013;39(1)：8-11.

2Jiang T，Tang GF，Lin Y，etal.Prevalence estimates for primary brain tumors in china：a multi-center cross-sectional study〔J〕.Chin Med J，2011;124(17)：2578-83.

3于 赫，李 冀，齊 彥.五味子多糖對肝癌小鼠腫瘤生長的抑制作用及其免疫學機理初探〔J〕.中醫藥信息，2010;27(2)：26-7.

4許珂玉，肖建英.五味子多糖對甲狀腺癌細胞株SW579凋亡及survivin表達的影響〔J〕.吉林大學學報(醫學版)，2011;37(2)：279-83.

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6甘 露.五味子多糖對肝癌小鼠腫瘤生長及免疫功能的調節作用〔J〕.免疫學雜志，2013;29(10)：867-70.

7溫 娜，唐澤波，袁 瑞，等.五味子粗多糖對腦膠質瘤細胞生長的作用〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(12)：2837-8.

8Hardwick JM，Chen YB，Jonas EA.Multipolar functions of Bcl-2 proteins link energetics to apoptosis〔J〕.Trends Cell Biol，2012;22(6)：318-28.

9劉 英，郭世杰，孫景輝.缺氧缺血性腦損傷新生大鼠心肌細胞凋亡及凋亡蛋白Bax，Bcl-2表達的變化〔J〕.臨床兒科雜志，2009;27(12)：1172-6.

10Reed JC.Proapoptotic multidomain Bcl-2/Bax-family proteins：mechanisms，physiological roles，and therapeutic opportunities〔J〕.Cell Death Differ，2006;13(8)：1378-86.