厄貝沙坦對糖尿病大鼠心肌轉化生長因子-β1和結締組織生長因子表達的影響

劉 洋 胡翠寧

(錦州市中心醫院內分泌科，遼寧 錦州 121001)

心肌纖維化是糖尿病心肌病(DCM)的一個重要特征，是導致心肌收縮和舒張功能障礙的重要因素〔1〕。研究表明，轉化生長因子-β1(TGF-β1)和結締組織生長因子(CTGF)參與了DCM心肌纖維化的發生發展過程〔1〕。厄貝沙坦作為血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體拮抗劑可阻斷腎素-血管緊張素系統(RAS系統)，在DCM中發揮重要的心肌保護作用。本實驗通過建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型，并用厄貝沙坦進行干預，探討厄貝沙坦對DCM大鼠TGF-β1、CTGF的影響及其抑制心肌纖維化,改善心功能的機制。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；厄貝沙坦(商品名安博維，杭州賽諾菲安萬特制藥有限公司)；兔抗大鼠TGF-β1、CTGF多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；BL-420F生物機能實驗系統(上海康為醫療科技發展有限公司)；One Touche 血糖儀(美國強生公司)；CIAS-1000細胞圖像分析儀(北京大恒圖像視覺有限公司)；JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本)。

1.2動物分組、模型制備及給藥方法 健康雄性SD大鼠30只，體重(BW)200～250 g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供。適應性喂養1 w后，隨機抽取30只給予高糖高脂飼料(飼料組成：10.0%豬油、20.0%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%常規飼料)喂養，4 w后禁食12 h，給予1% STZ 30 mg/kg尾靜脈一次性注射，臨用前用0.1 mmol/L pH值為4.5的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配制，72 h后尾靜脈采血測血糖≥16.7 mmol/L為造模成功〔2〕。其余10只作為正常對照組，給予常規飼料喂養，4 w后注射等體積枸櫞酸鈉緩沖液。將20只造模成功大鼠隨機分為糖尿病模型組、厄貝沙坦組，每組10只。厄貝沙坦組灌胃給予厄貝沙坦50 mg·kg-1·d-1，正常對照組、糖尿病組每日灌胃給予等體積的生理鹽水，連續用藥12 w結束實驗。每周用血糖儀測一次尾靜脈血血糖，血糖<16.7 mmol/L者及時剔除實驗。

1.3血流動力學指標檢測 12 w末，各組大鼠斷尾采血測血糖后稱體重(BW)，用20%的烏拉坦(4 ml/kg)腹腔注射麻醉，于頸部偏右側開縱形切口，分離右側頸總動脈，經右頸總動脈插管至左心室，連接BL-420F生物機能實驗系統，測定左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室壓力上升及下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.4心臟重量指數(HWI)和左心室重量指數(LVWI)測定 將大鼠迅速開胸取出心臟，冰生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱心臟重量(HW)，剖取心臟，將左右心房和右心室剪去，剩余部分即為左心室，稱左心室重量(LVW)。計算HWI(HW/BW)和LVWI(LVW/BW)。從左心室取部分心尖部組織，置于10%中性甲醛中固定，用于光鏡觀察心肌組織形態學改變和免疫組化法檢測TGF-β1、CTGF的表達；剩余心尖部組織置于2.5%戊二醛中固定，用于電鏡觀察心肌組織超微結構變化。

1.5HE染色光鏡觀察心肌組織形態學改變 取置于10%中性甲醛中固定的部分心尖部組織，脫水透明浸蠟，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察心肌組織形態學改變。

1.6免疫組化法檢測TGF-β1、CTGF蛋白表達 采用SABC法，一抗為兔抗大鼠TGF-β1、CTGF多克隆抗體，按試劑盒說明書進行操作，顯微鏡下觀察細胞質出現棕黃色顆粒為陽性表達，每張切片選取5個視野，應用CIAS-1000細胞圖像分析系統進行圖像分析，測定平均光密度值(OD值)，取其均值。

1.7電鏡觀察心肌組織超微結構變化 每組隨機選取2只大鼠心尖部組織，切成1 mm3大小組織塊，置于2.5%的戊二醛溶液中固定2 h，1%鋨酸固定1 h后，乙醇梯度脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片(50 nm)后醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，JEM-1200EX透射電鏡觀察各組大鼠心肌組織超微結構變化。

1.8統計學分析 應用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1一般狀況比較 正常對照組：體重明顯增加，精神狀況良好，皮毛有光澤，反應靈敏。糖尿病組：精神萎靡，明顯消瘦，出現多飲、多尿，弓背蛇體，皮毛無光澤，活動減少，反應遲鈍。厄貝沙坦組：精神狀況較好，反應靈敏度較正常對照組稍差，但仍高于糖尿病組。實驗過程中糖尿病組大鼠死亡2只，厄貝沙坦組死亡1只，死亡原因是血糖過高導致糖尿病酮癥酸中毒、感染。

2.2大鼠血流動力學結果比較 與正常對照組比較，糖尿病組大鼠LVEDP明顯升高(P<0.01)，LVSP和±dp/dtmax明顯降低(P<0.01)；與糖尿病組比較，厄貝沙坦組LVEDP明顯降低(P<0.01)，LVSP和±dp/dtmax升高(P<0.05和P<0.01)，見表1。

2.3大鼠血糖、BW、HWI、LVWI比較 與正常對照組比較，糖尿病組和厄貝沙坦組血糖明顯升高(P<0.01)，糖尿病組和厄貝沙坦組血糖比較無明顯差別(P>0.05)；糖尿病組大鼠HWI、LVWI高于正常對照組(P<0.01)；厄貝沙坦組HWI、LVWI低于糖尿病組(P<0.05和P<0.01)，見表2。

表1 各組大鼠血流動力學結果比較

表2 各組大鼠血糖、BW、HWI、LVWI比較

2.4HE染色光鏡下觀察心肌組織形態學變化 正常對照組大鼠心肌細胞排列整齊致密，細胞核呈圓形或橢圓形，大小均勻，細胞間質正常，肌纖維排列整齊，無斷裂；糖尿病組心肌細胞肥大、腫脹、壞死，邊界不清，間質及間質膠原較多，肌纖維部分斷裂，排列明顯紊亂；厄貝沙坦組心肌細胞變性壞死程度和間質纖維化程度范圍明顯減輕，見圖1。

圖1 大鼠心肌組織HE染色結果(×200)

2.5電鏡下觀察心肌組織超微結構變化 正常對照組大鼠心肌細胞核呈橢圓形，染色質均勻分布，肌絲結構清楚，Z帶和I帶整齊規則，未見肌絲溶解，線粒體結構正常清晰，細胞間質較少。糖尿病組心肌細胞核輕度腫脹，染色質分散分布，線粒體結構模糊，細胞器結構紊亂，肌絲結構不清，肌纖維間隙增寬，肌絲溶解，Z帶和I帶部分走行紊亂，間質膠原纖維增多，心肌纖維化明顯。厄貝沙坦組心肌病變明顯減輕，部分肌原纖維排列紊亂，線粒體水腫減輕，細胞間質減少。

2.6心肌組織TGF-β1、CTGF的蛋白表達結果比較 見表3，圖2,圖3。與正常對照組比較，糖尿病組心肌組織TGF-β1、CTGF的表達明顯升高(P<0.01)；與糖尿病組比較，厄貝沙坦組心肌組織TGF-β1、CTGF的表達明顯降低(P<0.01)。

表3 各組大鼠心肌組織TGF-β1、CTGF的平均OD值比較

圖2 大鼠心肌組織TGF-β1表達(×400)

圖3 大鼠心肌組織CTGF表達(×400)

3 討 論

DCM以心肌細胞肥大、凋亡、心肌間質膠原沉積和纖維化為主要特征，是糖尿病患者晚期的主要死亡原因之一。STZ誘導糖尿病大鼠于成模后8 w左右就可以出現DCM的表現。本實驗采用高脂高熱量飲食誘導出胰島素抵抗，加尾靜脈注射小劑量STZ建立DCM動物模型成功。經厄貝沙坦干預后，心肌病變明顯減輕，與多數研究結果相一致〔3〕。

本實驗表明TGF-β1、CTGF與DCM的發生發展過程有密切關系，這一結論與郎宏濤等〔4〕的研究相似。TGF-β1是最重要的致心肌間質纖維化細胞因子之一。TGF-β1是多功能生長因子，一方面對許多組織器官的生長分化起著重要作用，另一方面通過發揮促進心肌細胞肥大，促進細胞外基質(ECM)如FN、Ⅱ型膠原等的合成和抑制ECM降解，使ECM在細胞周圍沉積，膠原增生等作用造成糖尿病的靶器官損傷，參與了DCM的發病過程，導致心功能不全，最終導致心力衰竭的發生。研究發現，糖尿病時高血糖〔5〕、AngⅡ〔6〕、糖尿病時晚期糖化終末產物(AGEs)〔7，8〕、一氧化氮〔9〕等多種因素均可引起心肌組織中TGF-β1升高，因此，抑制心肌組織中TGF-β1的高表達成為DCM治療的靶標。

Piet等〔10〕研究發現，在擁有人類腎素及血管緊張素原基因的轉基因鼠中，CTGF表達水平增高的同時伴有TGF-β1、Ⅰ型膠原基因和Ⅲ型膠原基因表達增高。大量文獻表明TGF-β1是CTGF的強誘導劑，在CTGF的啟動子-157至-145核苷酸序列存在一個新的應答元件，CTGF是TGF-β1發揮纖維化作用的下游效應介質。因此，TGF-β1的生物學作用部分由CTGF介導的。體外實驗發現TGF-β1可引起人心臟心肌細胞及成纖維細胞中CTGF mRNA表達增高，并伴隨細胞外基質的產生增加，CTGF的拮抗劑可抑制TGF-β1誘導的致纖維化作用。

DCM病后腎素-血管緊張素醛固酮系統(RAS)系統處于激活狀態，心肌局部AngⅡ可直接通過蛋白激酶C(PKC)途徑引起TGF-β1過度表達，并通過細胞表面的AT1受體介導CTGF表達增加，兩者均可促進心肌間質纖維化以及細胞外基質膠原沉積，導致心肌肥厚及纖維化，最終導致心室收縮及舒張功能受損〔11〕。厄貝沙坦為AT1受體拮抗劑，可阻止AngⅡ與AT1受體結合，阻斷內源性及外源性AngⅡ引起的心肌纖維化。在STZ誘導糖尿病大鼠模型中，心肌組織CTGF表達和AngⅡ含量呈明顯的正相關，厄貝沙坦干預后，CTGF表達和AngⅡ含量均降低〔12〕。研究表明，短期或長期應用AngⅡ可導致STZ大鼠心肌細胞凋亡，AT1受體拮抗劑氯沙坦則可減輕DCM大鼠心肌纖維化并改善心功能〔13，14〕。本實驗表明厄貝沙坦通過選擇性地與AT1受體結合降低了TGF-β1的表達，從而間接影響了CTGF的表達，并且在抑制心肌纖維化的同時，改善了糖尿病大鼠的心功能。

本實驗表明厄貝沙坦通過降低DCM心肌組織TGF-β1和CTGF的表達，發揮抑制心肌間質纖維化，改善心功能的作用，從而為DCM進展為心力衰竭提供了新的治療靶點，為厄貝沙坦治療DCM提供了有力的實驗依據。

4 參考文獻

1Hayat SA,Patel B,Khattar R，etal.Diabetic cardiomyopathy：mechanisms，diagnosis and treatment〔J〕.Clin Sci(Lond),2004；107(6):539-57.

2王 祥，李長運，曾秋棠.大鼠2型糖尿病心肌病模型的建立方法〔J〕.中國病理生理雜志,2006；22(9):1868-70.

3鐘 明，張 運，苗 雅，等.纈沙坦逆轉糖尿病心肌病大鼠心肌間質纖維化的作用〔J〕.中華醫學雜志,2006；86(4):232-6.

4郎宏濤，劉素筠.氯沙坦鉀和辛伐他汀對1型糖尿病大鼠心肌中CTGF和TGF-β1的影響〔J〕.中國醫療前沿,2011；6(3):19-21.

5Tokudome T,Horio T,Yoshihara F,etal.Direct effects of high glucose and insulin on protein synthesis in cultured cardiac myocytes and DNA and collagen synthesis in cardiac fibroblasts〔J〕.Metabolism,2004；53(6)：710-5.

6Connelly KA,Kelly DJ,Zhang Y,etal.Functional,structural and molecu-lar aspects of diastolic heart failure in the diabetic(mRen-2)27 rat〔J〕.Cardiovasc Res,2007；76(3):280-91.

7Aragno M,Mastrocola R,Alloatti G,etal.Oxidative stress triggers cardiac fibrosis in heart of diabetic rats〔J〕.Endocrinology,2008；149(1)：380-8.

8Lee Cl,Guh JY,Chen HC,etal.Advanced glycation end-product-induced mitogenesis and collagen production are dependent on angiotensin Ⅱ and connective tissue growth factor in NRK-49F cells〔J〕.Cell Biochem,2005；95(2):281-92.

9Cai L,Wang Y,Zhou G，etal.Attenuation by metallothionein of early cardiac cell death via suppression of mitochondrial oxidative stress results in a prevention of diabetic cardiomyopathy〔J〕.J Am Coll Cardiol，2006；48(8):1688-97.

10Piet F,Kaija I,Juhani A,etal.Connective tissue growth factor gene expression via calcineurin - dependent pathways〔J〕.Am J Pathol,2003；163(1):355-66.

11Xu J,Carretero O,Lin C,etal.Role of cardiac overexpression of ANG Ⅱin the regulation of cardiac function and remodeling postmyocardial infarction〔J〕.Am J Physiol-Heart and Circ Physiology,2007；293(3):H1900-H7.

12吳 偉，高俊杰，王萌煒.心肌營養素-1和結締組織生長因子在糖尿病大鼠心肌中的表達及厄貝沙坦的干預作用〔J〕.中國組織化學與細胞化學雜志，2009；18(5):576-83.

13Zhou G,Li X,Hein DW,etal.Metallothionein suppresses angiotensin Ⅱ-induced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase Activation,nitrosative stress,apoptosis,and pathologicalremodeling in the diabetic heart〔J〕.J Am Coll Cardiol，2008；52(8):655-66.

14胡 圣，張緒洪，董 波，等.氯沙坦及A779對糖尿病心肌病大鼠心肌間質纖維化的影響〔J〕.山東大學學報(醫學版),2008；46(4):362-5.