KRAS基因遺傳變異對結直腸癌患者預后評估的價值

劉學偉 程龍偉 柴淑梅 李 澤

(吉林省腫瘤醫院結直腸外科，吉林 長春 130012)

結直腸癌是十分常見的惡性腫瘤，其發生發展、侵襲轉移及預后已經被證明是多種癌基因、抑癌基因及錯配修復基因突變共同參與調控的結果。表皮生長因子受體(EGFR)信號通路在結直腸癌發生及進展中起到至關重要的作用。KRAS基因屬于Ras原癌基因家族中的一員，KRAS基因突變以點突變為主，90%多集中于12、13密碼子，且12密碼子的突變率高于13密碼子〔1〕。研究發現轉移性結直腸癌KRAS基因野生型患者可在接受西妥昔單抗治療中受益，因此研究KRAS基因突變為結直腸癌的預后及治療提供了參考依據。目前關于結直腸癌KRAS基因突變的報道較少，本研究應用PCR-SSCP方法檢測78例結直腸癌患者KRAS基因突變表達譜情況與臨床病理因素及預后之間的相關性。

1 資料與方法

1.1組織標本 78例石蠟包埋組織標本取自吉林省腫瘤醫院，患者手術時間為2008年1月至2010年8月，其中男43例，女35例；年齡60～87〔平均(54±6)〕歲。術前均未行放化療，術后根據國際抗癌聯盟(UICC)制定第7版腫瘤TNM分期進行術后分期，并明確病理診斷。患者年齡、性別、一般狀況無明顯差異。組織標本采集獲得我院倫理委員會批準研究。78例患者由腫瘤研究委員會追蹤隨訪至2011年7月。

1.2方法 樣本DNA的提取：選擇經蘇木素-伊紅(HE)染色證實存在癌組織并占60%以上的蠟塊，切取3張10 μm厚組織，裝入1.5 ml已消毒離心管，常規脫蠟處理后，加入蛋白酶K至終濃度1 mg/ml，十二烷基硫酸鈉(SDS)至2%。孵育24～36 h后，離心處理(15 000 r/min，15 min，4℃)。抽取石蠟層下的液體。按照QIAamp DNA FFPF Kit試劑盒(Qiagen公司)步驟提取石蠟組織DNA，最后以30 μl洗脫液洗脫DNA，DNA產物用紫外分光光度計檢測DNA濃度，調節到100 μg/ml，-20℃保存備用。

KRAS基因的PCR擴增及測序：根據Jhawer等〔2〕文獻所述，選擇擴增12/13號密碼子所需特異性引物，引物序列為：5'：AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATA-3'(正義)；5'：CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3 '(反義)。PCR反應體系50 μl，包含2 μl模版DNA，10 μmol/L正、反各1 μl，25 μl Premix(含1.5 U TaKaRa Taq；10×PCR Buffer，3.0 mmol/L Mg2+；0.4 mmol/L dNTP Mix)，引物及Premix PCR檢測試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。

PCR 反應條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，循環30次，循環結束4℃保持，PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統觀察和分析結果。選取PCR陽性DNA凝膠條帶作為目的片段，采用QIAquick PCR Purification Kit 對PCR產物進行回收(Qiagen公司產品)，后送上海基因技術有限公司測序。

1.3統計學方法 應用SPSS19.0軟件行χ2檢驗Kaplan-Meier生存曲線評價KRAS基因突變與患者生存期的關系，顯著性檢驗采用Log-rank檢驗分析，Cox回歸模型進行多變量生存分析。

2 結 果

2.1KRAS基因突變結果 78例結直腸癌患者中，KRAS基因突變26例(33.3%)。KRAS基因12號密碼子突變19例(73.1%)；13號密碼子突變7例(26.9%)。KRAS基因突變均為單個堿基的點突變，未檢測出兩個或以上的堿基突變或其他形式的突變(圖1)。其中G-A突變發生頻率最高，共20例(76.9%)；其次G-T突變5例(19.2%)；G-C突變僅1例(3.9%)。KRAS基因12號密碼子突變19例，共有3種不同突變方式：GGT-GAT突變13例(50%)，導致甘氨酸Gly替換為天冬氨酸Asp；GGT-GTT突變5例(19.2%)，導致甘氨酸Gly替換為纈氨酸Val；GGT-GCT突變1例(13.9%)，導致甘氨酸Gly替換為丙氨酸Ala。13號密碼子突變7例(26.9%)，均為GGC-GAC突變，導致甘氨酸Gly替換為天冬氨酸Asp。在氨基酸替換中，Gly替換為Asp發生頻率最高，占76.9%(20/26)；其次Gly替換為Val占19.2%(5/26)；Gly替換為Ala發生頻率最低，僅占3.8%(1/26)。

2.2KRAS基因突變表達譜與臨床病理因素的關系 KRAS基因突變與結直腸癌分化程度、肝轉移具有統計學意義(P<0.05)。KRAS基因突變與其他病理學參數如性別、年齡、腫瘤大體類型、腫瘤原發部位、淋巴結轉移、TNM分期均無統計學意義(P>0.05)。78例患者追蹤隨訪發現，KRAS基因野生型患者平均生存時間35.05個月，突變型患者是25.72個月，有統計學意義，(χ2=5.13,P= 0.023)。KRAS基因12號密碼子突變患者平均生存時間是25.69個月，13號密碼子突變患者是20.67個月，兩組無統計學意義(P>0.05)。單變量分析顯示KRAS基因突變與結直腸癌患者預后不良關系密切(P=0.023)，多變量分析顯示肝臟轉移、KRAS基因突變、腫瘤低分化是預后的獨立危險因素(P=0.001,0.007,0.026)。見表1，圖2。

a.KRAS基因12、13密碼子野生型基因序列;b.KRAS基因12密碼子GGT→GAT突變;c.KRAS基因12密碼子GGT→GTT突變;d.KRAS基因13密碼子GGC→GAC突變

表1KRAS基因突變表達與結直腸癌臨床病理學因素的關系〔n(%)〕

臨床病理因素n野生型突變型χ2值P值性別 男4326(60.5)17(39.5)1.66>0.05 女3526(74.3)9(25.7)年齡(歲) ≤603828(73.7)10(26.3)1.64>0.05 >604024(60.0)16(40.0)大體類型 隆起型1712(70.6)5(29.4)0.15>0.05 潰瘍型6140(65.6)21(34.4)部位 右半結腸209(45.0)11(55.0)5.72>0.05 左半結腸1813(72.2)5(27.8) 直腸4030(75.0)10(25.0)分化程度 中分化5943(55.8)16(27.1)4.21<0.05 低分化199(47.7)10(52.6)淋巴結轉移 有5035(70.0)15(30.0)0.7>0.05 無2817(60.7)11(39.3)肝轉移 無4836(75.0)12(25.0)3.90<0.05 有3016(53.3)14(46.7)TNM Ⅰ+Ⅱ3828(75.0)10(25.0)1.642>0.05 Ⅲ+Ⅳ4024(53.3)16(46.7)

圖2 78例大腸癌患者KRAS基因野生型與突變型的Kaplan-Meier生存曲線

2.3患者多因素的COX模型分析與預后相關獨立危險因素 見表2。

表2 78例大腸癌患者的多因素COX模型分析與預后相關的獨立危險因素

3 討 論

KRAS基因在結直腸癌患者突變率發生較高，本研究中KRAS基因突變率、特點的結果符合目前各研究機構所報道KRAS基因突變的一般情況〔3，4〕。結直腸癌發生是多步驟過程，從腸道黏膜增生到良性腺瘤最后到結直腸癌的惡性轉變都與KRAS基因突變有關，因此KRAS基因突變被認為是結直腸癌發生的啟動因子，尤其是G-A堿基突變被認為在結直腸癌發生中起到重要作用。本研究發現G-A突變頻率發生最高，這說明G-A突變是KRAS基因突變中的普遍現象。

目前對KRAS基因突變表達譜與結直腸癌臨床病理因素關系的報道不盡相同。有研究稱KRAS基因突變與結直腸癌患者年齡、性別、腫瘤分化程度、TNM分期等病理學因素無任何關系〔5〕。不同研究機構發現KRAS基因突變與某些臨床病理因素之間存在聯系〔6，7〕。Yunxia等〔8〕發現結直腸腫瘤分化程度可能與KRAS基因突變存在潛在的關系，本研究結果高于2008年ASCO會議上報道轉移性結直腸癌患者35% 的KRAS 基因突變率。這可能由于本研究中樣本量受限所致或是本研究中只包括結直腸癌肝臟轉移，而沒有包括結直腸癌肺轉移或者其他遠處轉移的患者。結直腸癌分化程度差，惡性程度高，轉移能力強，KRAS基因突變發生可能性越高，但仍需要大樣本臨床數據來證實中國人結直腸癌患者的KRAS基因突變情況。

關于KRAS基因突變與結直腸癌的預后，仍然存在不同觀點。研究發現Dukes C期結直腸癌患者12號密碼子Gly突變為Val預后差、13號密碼子G突變為A，預后差，生存期短〔9〕。KRAS基因野生型可受上游EGFR信號通路的調控，KRAS基因發生點突變時，該基因編碼P21蛋白的空間結構發生變化，不受上游EGFR信號影響。KRAS基因突變亞型不同，可能導致該基因空間構象不同，調節細胞內信號通路不同，對化療藥物的結合位點存在差異，這就可能導致不同突變亞型對化療藥物敏感性不同，而造成預后生存期明顯不同。

綜上所述，中國結直腸癌患者的KRAS基因突變率符合目前國際各研究機構的報道。KRAS基因的遺傳變異在結直腸癌的發生、進展中起重要作用。分析KRAS基因不同亞型突變表達譜有助于評估結直腸癌患者預后。

4 參考文獻

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