PAI-1基因4G/5G多態性、FⅦ基因R353Q多態性與冠心病的相關性

趙曉輝 劉 鵬 葛 斌 靳鳳琳 韓子強

(泰山醫學院附屬醫院心內一科，山東 泰安 271000)

冠心病(CHD)是由多基因遺傳因素及環境因素共同作用引起的一種復雜的疾病，血液凝溶系統失衡在CHD的發病過程中所起的作用不容忽視。PAI-1是纖溶系統關鍵的調節因子，起著決定性作用，PAI基因的很多位點存在多態性，其基因多態性中4G/5G多態性與CHD關系密切目前國外心血管領域以4G/5G插入或缺失多態性研究較多考慮到人種不同及比較均衡的因素不同，PAI基因多態性與CHD及CHD危險因素之間的關系需要進一步研究證實。國外研究報道血漿FⅦ活性(FⅦC)增高是CHD發生的危險因素〔1，2〕。 凝血因子在外源性凝血途徑中起關鍵作用，但其他研究組未能重復出類似的研究結論,可能由于血液中FⅦC的測定易受飲食、運動和藥物治療等因素的影響,因此FⅦ 基因多態性研究也許可以提供一條新的途徑。

1 對象與方法

1.1對象 病例選自2010年4～10月泰山醫學院附屬醫院的心內科病房。CHD患者146例，男98例，女48例，年齡為(65±10)歲，甘油三酯〔TG，(1.84±1.58)mmol/L〕，血糖〔BS，(6.05±2.34)mmol/L〕，高密度脂蛋白〔HDL，(1.24±0.41)mmol/L〕，收縮壓〔SBP，(137.21±21.50)mmHg〕。病例符合1979年世界衛生組織(WHO)關于缺血性心臟病的命名和診斷標準〔1〕，部分病例經冠狀動脈造影確診〔2〕。冠脈造影時，各主要分支存在>50%狹窄定義為有意義病變，113例正常人選自人群健康體檢的隨機個體本研究人群個體之間無血緣關系作為對照，排除冠心病糖尿病高血壓患者，男71例，女42例，平均年齡(64±8)歲，TG(1.29±0.57)mmol/L，BS(5.18±0.94)mmol/L，HDL(1.35±0.39)mmol/L，SBP(128.04±14.02)mmHg。

1.2基因型的確定 采用PCR-RFLP技術進行基因型分析，酚-氯仿法提取外周血基因組DNA， PAI-1基因參考Margaglione等〔3〕設計引物，由海上生工(Sangon公司)合成，上游引物序列5′-CACAGAGAGAGTCTGGCCACGT-3′;下游引物序列為5′-CAGCCACTGGATTGT-CTAGGT-3′， FⅦ基因參考Bernardi等〔4〕設計引物，上游引物序列5′-TGATGACCCA-GGACTGCCT-3′，下游引物序列為5′-GGATTTGGTGCCAGGACAG-3′，由上海生工(Sangon公司)合成。反應體系25 μl,其中含10倍PCR緩沖液2.5 μl，MgCl21.2 mmol/L，DNTP 0.24 mmol/L，模板DNA 0.12 μg，Tap酶1 U。上下游引物各0.75 μmol。擴增條件：94 ℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環后，72℃延伸5 min，取5 μl PCR產物，加入10倍Buffer 2 μl，FⅦ基因PCR產物經MspⅠ酶切，PAI-1基因PCR產物經BSⅡ酶切，限制性內切酶1 μl，去離子水12 μl，55℃酶切3 h，酶切產物用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色檢測，確定基因型。

1.3統計學分析 資料用SAS軟件行t及χ2檢驗；應用非條件Logistic回歸模型，對各原始變量采用逐步法建模。

2 結 果

2.1酶切產物的判定 PAI-1基因PCR產物為142 bp經BSⅡ酶切消化后產生不同的特異性片段，形成3種基因型：4G/4G基因型：只存在一個基因酶切位點，產生96 bp和46 bp 2條帶；5G/5G基因型：存在2個酶切點，產生74 bp、46 bp和22 bp 3條帶；4G/5G基因型：同時具有96 bp、74 bp、46 bp和22 bp 4條帶。其中22 bp條帶在10% PAG膠電泳中跑出，見圖1。

FⅦ基因PCR產物為312 bp經MspⅠ酶切消化后產生不同的特異性片段，形成3種基因型： RR基因型產生 206 bp、67 bp和39 bp三種片段，RQ基因型產生 273 bp、206 bp、67 bp和39 bp四種片段，QQ基因型有273 bp和39 bp兩種片段，見圖2。

2.2PAI-1基因型和等位基因頻率分布 如表1所示，4G/4G、4G/5G、5G/5G三種基因型和等位基因頻率病例和對照組間無顯著差異(χ2=4.52，P=0.11；χ2=2.17，P=0.14)；相比與含有5G等位基因的基因型，4G/4G基因型分布在病例和對照組間有顯著差異(χ2=4.05，P=0.44)。

1～8：5G/5G，4G/5G，5G/5G，4G/5G，4G/4G，4G/4G，4G/4G，5G/5G

1～9：RR，PQ，RR，RR，RQ，QQ，RR，QQ，RR，RR

表1PAI-1基因型和等位基因頻率分布〔n(%)〕

組別n基因型5G/5G4G/5G4G/4Gχ2值P值5G/5G+4G/5G4G/4Gχ2值P值等位基因頻率(%)5G4Gχ2值P值CHD組14632(21.9)68(46.6)46(31.5)4.5190.114100(68.5)46(31.5)4.0540.04445.254.82.1660.141對照組11333(29.2)57(50.4)23(20.4)90(79.6)23(20.4)54.445.6

2.3PAI-1基因型與CHD 與5G/5G相比，4G/5G，4G/4G的OR隨4G等位基因的增加呈增加趨勢，并且與含5G等位基因的基因型相比，4G/4G基因型與冠心病的病因關聯指標有統計學意義(P=0.04)，提示4G/4G基因型與冠心病的危險性相關(P<0.05)。4G/4G基因型的OR值為2.06，即表明具有4G/4G基因型比具有5G/5G基因型的人患冠心病的危險性增加2.06倍(95%CI：1.03～4.14)，見表2。

2.4FⅦ基因型與CHD FⅦ基因型分布病例組與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，本實驗QQ基因型較少，結合QQ+PQ基因型頻率與RR型相比，FⅦ基因型分布病例組與對照組相比亦無顯著差異(P>0.05)。上述各組R、Q等位基因頻率相比，CHD組與對照組亦無顯著差異(P均>0.05)。見表3。用Logistic回歸分析FⅦ基因型與CHD危險性間的關系發現，盡管Q等位基因有使得CHD患病降低的趨勢但尚未達到統計學意義(β=-0.204，SE=0.407，P=0.617，95%CI=0.37～1.81)。

表2 PAI-1基因型與CHD危險性的關系

表3 FⅦ基因型與等位基因頻率分布〔n(%)〕

3 討 論

目前CHD被認為是多種遺傳和環境因素相互作用所致的復雜的多基因遺傳病。國外資料顯示，PAI-1基因主要有三種多態性與血管病變有關：4G/5G插入或缺失多態性、二核苷酸(C-A)n重復序列多態性、HindⅢ限制性片段長度多態性(RFLP)，目前國外心血管領域以4G/5G插入或缺失多態性研究較多〔4～6〕。經過對本研究人群資料的計算，正常人、CHD組PAI-1基因型頻率分布均符合HarDY-Weinberg平衡〔7，8〕，說明本研究人群具有群體代表性，不存在選擇偏倚。本研究與Mansfield等〔9〕研究結果一致，其作用的機制可能4G/4G基因型顯著影響PAI-1的活性，血漿PAI-1活性增高引起纖溶活性降低,導致纖維蛋白清除減少,引起纖維蛋白沉積;同時,PAI-1抑制血管外基質的水解,限制血管外平滑肌遷移;另外,纖維蛋白與血管壁結合,通過刺激平滑肌細胞增殖而促進動脈粥樣硬化斑塊的生長。廣泛動脈粥樣硬化引起血管內皮細胞損傷，導致PA合成能力降低，儲存、釋放減少；內皮細胞受損后，血管平滑肌細胞浸潤、增生、合成和分泌大量的PAI-1；激活的血小板釋放大量的PAI-1進一步抑制了PA，血中PAI-1增多；PA減少，PAI-1的增多，血液運輸功能下降，加重內皮損傷，形成惡性循環。另外本實驗未發現基因型與心肌梗死的關系，雖然4G/4G基因型相比與非4G/4G型(4G/5G+5G/5G)，有使心肌梗死發病升高的趨勢，但尚未達到統計學意義，與Eriksson等〔10〕研究結果不相符。此外PAI-1基因4G/5G多態性與冠脈病變程度，以及冠脈支架術后在狹窄率的關系如何需進一步研究明確。本研究將RQ和QQ聯合分析，與RR基因型相比，RQ+QQ型有使冠心病，心肌梗死發病危險性降低的趨勢，但都未達到統計學意義，這一結果的得出可能與種族有關。

4 參考文獻

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