海州香薷總黃酮對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護作用

邱國權

(白城醫學高等?？茖W校，吉林 白城 137000)

冠心病是危害老年人健康的嚴重疾病之一，抗冠心病藥物的研究一直是國內外研究熱點，相關研究顯示〔1，2〕，香薷屬植物多數具有良好的抗氧化、清除氧自由基的作用，其中黃酮是香薷屬植物起藥理作用的物質基礎。為研究海州香薷總黃酮(THES)對缺血再灌注損傷的保護作用，本次研究通過建立大鼠離體心臟缺血再灌注模型，研究THES對大鼠離體心臟缺血再灌注的改善效果，以期為臨床預防缺血再灌注損傷提供新的有效藥物。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 TFES由本校藥學院提供，總黃酮含量92.47%。本次實驗中考馬斯亮藍蛋白檢測試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒、氯化三苯四氮唑測試盒均購于上海浩然生物技術有限公司，余下的試劑均為市售分析純。K-H液配置：NaCl 118 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L，pH7.4。

1.2大鼠離體心臟缺血再灌注模型建立 雄性SD大鼠，斷頭之后立即開胸取出心臟，放于4℃的K-H液中清洗血液后迅速轉移并固定在Langendorff離心心臟灌流系統上，用K-H液進行常規恒壓(76 mmHg)灌流，并流通95%O2+5%CO2飽和氣體，保持灌流液溫度37℃。將充水后的乳膠囊經過切開的左心耳位置插進左心室中，內囊壓經過特氟綸管將壓力轉送至壓力轉換器，采用RM6240多道生理信號采集處理系統對數據進行記錄和分析。心肌缺血再灌注的過程為平衡30 min，停止灌注40 min，復灌120 min。

1.3實驗動物和分組 健康清潔級Wistar雄性大鼠30只，體重240～260 g。購于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，動物合格證號：SCXK(吉)：2011-0004。隨機分為五組，每組6只，分別為正常對照組，在K-H液平衡30 min之后，繼續灌流180 min；I/R組，在K-H液平衡30 min之后，繼續灌流30 min，全心停止灌流40 min模擬缺血過程，之后再灌注120 min；TFES低、中、高劑量組，同I/R組，但在停止灌流前10 min分別給予含TFES 1、10、100 μg/ml的K-H液灌流。

1.4血流動力學檢測 本次研究選用RM6240多道生理信號采集處理系統對多項血流動力學指標進行檢測。首先向插入左心室的乳膠囊注水，將左心室的舒張末期壓力維持在4～8 mmHg，對研究過程中心率壓力乘積(RPP)、冠脈流量(CF)、左心室內壓力最大升降速率(±dP/dtmax)。

1.5心肌梗死程度檢測 從灌流裝置上將心臟取下后放于-20℃冰箱中2 h，沿著心臟長軸垂直的方向將其切成2 mm的切片，置于37℃水浴中用1%的氯化三苯四氮唑孵育30 min。將心肌切片取出后用紗布吸干表面的水分并進行稱重，按照20 ml/g的量加入二甲基亞砜進行組織勻漿，在2 700 r/min條件下將勻漿液離心10 min后取上清液1 ml，在490 nm處測量其吸光度。心肌缺血損傷可導致細胞線粒體呼吸酶的活性降低，可導致心肌組織分解氯化三苯四氮唑，導致紅色產物Formazan量減少。本次研究中對其含量進行準確定量，進而對大鼠心肌缺血性損傷和TFES的保護作者進行評價。

1.6心臟流出乳酸脫氫酶活性檢測 在復灌各時間點對冠脈流出液進行收集，利用分光光度法檢測冠脈流出液中乳酸脫氫酶的含量。

1.7線粒體滲透性轉換孔開放的檢測 將線粒體用腫脹液(110 mmol/L KCl，20 mmol/L MOPS，10 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L K2PO4，pH 7.6)將蛋白濃度稀釋至0.30 mg/ml，同時在線粒體溶液中加入300 μmol/L的CaCl2溶液，誘導線粒體滲透性轉換孔開放，同時應用多功能酶標儀對520 nm處線粒體吸光度變化情況進行連續觀察10 min。

2 結 果

2.1TFES對缺血再灌注大鼠離體心臟血流動力學影響 各項心臟血流動力學指標在復灌期均出現異常。與正常對照組相比，I/R組RPP、CF、±dP/dtmax呈現進行性降低，提示造模成功。TFES 1、10、100 μg/ml劑量組各復灌時間點RPP、CF、±dP/dtmax均明顯高于I/R組(P<0.05，P<0.01)，且呈一定的劑量依賴性。見表1。

表1 各復灌時間點各組大鼠離體心臟血流動力學指標對比±s,n=6)

2.2TFES對缺血再灌注大鼠離體心臟心肌梗死程度影響 大鼠離體心臟停止灌流前用TFES 1、10、100 μg/ml進行預處理，與I/R組相比，TFES 10、100 μg/ml劑量組均能明顯提高心肌Formazan含量，差異有顯著統計學意義(P<0.01)；且隨給藥劑量的增大心肌Formazan含量提升效果更為明顯。

2.3TFES對缺血再灌注大鼠離體心臟冠脈流出液中乳酸脫氫酶含量影響 恢復灌流后30、60、90 min時間點TFES 1、10、100 μg/ml劑量組中流出液中乳酸脫氫酶含量均明顯低于I/R組(P<0.01)；且隨給藥劑量的增大流出液中乳酸脫氫酶含量降低更為明顯?；謴凸嗔骱?20 min時間點時TFES 1、10、100 μg/ml劑量組與I/R組之間差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4TFES對心肌線粒體滲透性轉換孔開放的影響 在分離出的離體心臟心肌細胞線粒體中加入200 μmol/L的CaCl2后能夠引起線粒體在520 nm處的吸光度降低，在給予TFES 1、10、100 μg/ml之后，CaCl2誘導的線粒體520 nm處吸光度降低被明顯抑制，與給藥前相比差異有顯著統計學意義(P<0.01)。

3 討 論

冠心病是老年人群中的高發病，由于老年人肝腎功能降低，對藥物毒副反應的耐受性下降，用藥安全性一直是臨床治療中的難點〔3〕。因此，尋找療效顯著，副作用小的藥物對于老年冠心病患者具有重要意義。本次研究中建立了大鼠離體心臟缺血再灌注模型，對心臟在自主狀態下對藥物的反映進行模擬。

急性心肌缺血性損傷梗死面積大小對于患者治療預后有著重要影響。心肌梗死面積的縮小常用于抗心肌缺血藥物療效的主要評價指標〔4〕。本研究提示TFES中、高劑量能有效減輕缺血復灌后心肌梗死程度。血流動力學指標常用于對心功能評價。心肌細胞中乳酸脫氫酶廣泛存在于胞漿膜中，機體正常情況下血清中該酶的含量極少，當出現缺血再灌注損傷時由于細胞膜及線粒體受到損傷，導致膜通透性提升，使乳酸脫氫酶釋放入血漿中，因此其可作為對心肌損傷程度的間接判斷指標。本研究提示TFES低、中、高劑量組均能起到保護心肌的作用。相關研究顯示〔5〕，心肌線粒體滲透性轉換孔開放是機體中多器官和細胞損傷或死亡的共同通路。本研究提示TFES保護心肌的機制可能與抑制心肌線粒體滲透性轉換孔開放有關。

綜上所述，TFES能明顯改善大鼠離體心臟缺血再灌注損傷，且呈劑量依賴性，隨著TFES劑量的升高，改善效果增強。本次研究為TFES進一步研發為修復心血管疾病的純中藥制劑提供了可行性依據。

4 參考文獻

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2張紅曉,劉 佳,宋玉峰,等.海州香薷根系對銅脅迫的抗氧化響應〔J〕.中國農學通報,2012;28(27):204-8.

3王衛紅,姚萬發.老年糖代謝異常人群冠心病發病率及其危險因素〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(21):5314-6.

4李 杰.老年急性冠脈綜合征患者血清MMP-9、NT-proBNP和hs-CRP水平與冠狀動脈病變程度的關系〔J〕.中國老年學雜志,2013；33(13):3221-2.

5郭 菁,熊蔚蔚,陶宇宏.乙酰水楊酸單用與聯用對不穩定型心絞痛治療效果比較〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2012;13(1):91-3.