依達拉奉對大鼠腦缺血后丘腦微血管密度、神經生長因子、腦源性神經生長因子表達的影響

朱 江 周志強 竇志杰 孫艷軍 張曉璇 邱海鵬

(承德醫學院附屬醫院神經內科，河北 承德 067000)

神經生長因子(NGF)和腦源性神經營養因子(BDNF)可以明顯促進缺血后神經元的存活和生長發育，改善神經元的病理狀態，促進神經元損傷后再生，在中樞神經系統損傷修復過程中發揮重要的作用〔1〕。依達拉奉是一種新型腦保護劑，通過捕獲羥自由基、抑制脂質過氧化作用〔2〕,抑制腦細胞的過氧化作用和延遲神經元死亡，減輕腦缺血、腦水腫和組織損傷〔3〕。本研究探討依達拉奉在腦缺血過程中起到的保護作用。

1 材料與方法

1.1動物與分組 Wistar成年健康雄性大鼠220～240 g，購于河北醫科大學實驗動物中心。60只大鼠隨機分為假手術組，治療組，缺血對照組；按時間點又分為7、14 d兩個亞組，其中假手術組每個亞組6只，其余每個亞組12只大鼠。

1.2腦缺血模型制備 結扎雙側頸總動脈：10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg),仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌，暴露分離出的雙側頸總動脈并結扎切斷，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。電凝椎動脈：大鼠俯臥固定，于后正中線第1頸椎水平處作縱形切口，沿中線分開肌層，暴露第1頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入右側橫突孔內凝閉椎動脈3～4 s，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。待清醒后，單籠保溫喂養。

1.3實驗動物的干預方法 假手術組只暴露雙側頸總動脈及右側椎動脈，不做血管阻斷處理。治療組、缺血對照組均在阻斷雙側頸總動脈及右側椎動脈后立即開始治療。治療組每天腹腔注射依達拉奉2次，時間間隔12 h，每次注射劑量按3 mg/kg計算。缺血對照組每天腹腔注射生理鹽水2次，時間間隔12 h，注射劑量為0.5 ml/次。治療組及缺血對照組均在術后7 d和14 d兩個時間點分別處死，取丘腦腦組織。

1.4實驗標本制作 應用10%水合氯醛 (350 mg/kg)腹腔注射。仰臥位固定于鼠板上，快速剪開腹腔和胸腔的前壁，清晰暴露出心臟，用連有輸液管的預先處理為鈍圓的針頭插入左心室內，快速輸入溫生理鹽水(37℃)100 ml，同時用眼科剪剪破右心耳，此時血液由右心耳處流出，待大鼠四肢末端變白，換上4%多聚甲醛(0.1 mol磷酸鹽緩沖液配成，pH7.4)灌流固定。灌流結束后取出腦組織，用冰生理鹽水沖洗，除去血液。石蠟包埋切片。

1.5觀察指標 ①微血管密度。②神經營養因子：NGF、BDNF蛋白表達測定用SP免疫組織化學染色法，所有切片染色均采用相同條件，每批染色均設陰性對照。陰性對照用PBS替代一抗孵育切片。結果判定：陽性細胞的胞質、胞膜、軸突呈棕黃色著色。圖像分析：采用Simple PCI-8圖像分析軟件。每只大鼠取3張切片，每張切片在光鏡下選5個視野，取平均灰度值進行統計學分析。該分析儀器的灰度級為0～256灰級，平均灰度表示陽性細胞的反應強度，平均灰級越高，說明反應強度越低。

2 結 果

2.1各組腦組織中NGF、BDNF灰度值的變化 治療組及缺血對照組灰度值較假手術組顯著增加，治療組NGF、BDNF灰度值增加的程度低于缺血對照組。見表1、表2。

2.2各組腦組織中微血管灰度的變化 治療組及缺血對照組的微血管灰度值較假手術組均增加，治療組增加的幅度低于缺血對照組。見表3。

表1 各組大鼠腦組織NGF蛋白陽性表達比較±s)

表2 各組大鼠腦組織BDNF蛋白陽性表達比較±s)

表3 各組大鼠腦組織微血管灰度值比較±s)

3 討 論

BDNF和NGF是神經營養素家族中的重要組成部分，對運動神經和其他中樞和外周神經系統是有效的生長因子〔4〕。BDNF和NGF主要在中樞神經系統合成。這些可溶性蛋白因子在中樞神經系統發育過程中對神經元生存、分化、生長和維持神經元正常生理功能等發揮關鍵作用〔5,6〕，能抑制神經元凋亡，促進神經元再生、塑形和與神經相關酶的合成。

神經元與分布在其周圍的神經膠質細胞、微血管及其相關的神經遞質、神經營養因子共同構成神經元單元。神經元單元之間相互聯系，共同構成中樞神經系統中的微環境穩態。腦缺血后出現神經元數量及微血管密度減少，神經膠質細胞數量增加。神經膠質細胞大量增生填充于壞死區域，引起局部微循環障礙，即微血管凋亡的數量大于其新生的數量。微環境的穩態被破壞，為重新建立這種平衡，神經元單元需要再生，在微環境再生中神經營養素家族發揮重要的作用。研究表明，腦缺血后BDNF、NGF表達增加〔7〕，通過拮抗興奮性氨基酸毒性，穩定細胞內鈣離子濃度，增強抗氧化酶活性，減輕自由基損傷；抑制細胞凋亡，增強蛋白酶活性；修復受損神經元，促進神經元再生機制〔8，9〕，重新建立內環境穩態。

本研究充分利用依達拉奉通過血腦屏障，抑制脂質過氧化反應，減輕腦組織花生四烯酸引起的腦水腫，縮小缺血半暗帶的面積，防止血管內皮細胞損傷等有效藥理作用，進一步提高BDNF、NGF表達，從而增加新生血管的密度。

本研究發現，提示依達拉奉通過清除自由基促進了神經生長因子的表達，起到了對神經元的保護作用。同時，進一步促進微血管密度增加，使得部分神經元單元得以修復完善，進而達到維護微環境穩態的目的。

4 參考文獻

1孫春艷，胡 豫，王雅丹，等.腦源性神經營養因子在多發性骨髓瘤患者血漿中的表達增高及其意義的初步探討〔J〕.中國實驗血液學雜志，2005;13(1)：104-9.

2李檢生，楊松有.新型自由基清除劑依達拉奉的腦保護作用〔J〕.國際神經病學神經外科學雜志，2006,33(2)：125-8.

3楊 政，吳玉林.治療急性腦梗死的新型腦保護藥依達拉奉〔J〕.中國新藥雜志，2002;11(12)：911-3.

4Bals R,Wang X,Wu Z,etal.Human beta-defensin2 is a salt-sensitive peptide antibiotic expressed in human lung〔J〕.Clin Invest,1998;102(5):874-80.

5Jia HP,Schutte BC,Schudy A,etal.Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach〔J〕.Gene,2001;263(1-2): 211-8.

6陳保國，黃渭清.腦源性生長因子神經損傷的修復劑再生〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復,2010;14(5):2805-9.

7Gura T.Inna immunity Ancient system gets new respect〔J〕.Science,2001;291(5511):2068-71.

8Lemaitre B,Reichhart JM.Drosophilia host defense differential induction of antimicrobial peptide genes after infection by various classes of microorganism〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1997;94(26):14614-9.

9王雅丹，胡豫，孫春艷.AKt、ERK1/2活化在腦源性神經營養因子促血管新生中的作用〔J〕.中國病理生理雜志，2007;23(5)：833-8.