雷公藤內酯醇對阿爾茨海默病模型大鼠海馬iNOS表達和突觸超微結構的影響

胡小令 桂 婷 黃濤波 呂 誠 李耀斌 薛國勇 溫 蔚 石嘉慶

(南昌大學醫學院解剖學教研室，江西 南昌 330006)

β淀粉樣蛋白(Aβ)異常沉積引起的慢性神經炎癥反應是阿爾茨海默病(AD)形成和發展的關鍵因素。誘導型一氧化氮合酶(iNOS)是炎癥中的一種反應性酶類，其產生的大量一氧化氮(NO)是炎癥損傷的重要因子之一，與Aβ的神經毒性密切相關〔1，2〕。抗炎藥物在治療AD方面可能具有一定的作用。從衛矛科植物雷公藤中分離出的雷公藤內酯醇具有抗炎、免疫抑制作用。本實驗探求雷公藤內酯醇治療AD的作用機制。

1 材料和方法

1.1主要試劑及儀器 Aβ1～40(Sigma公司)；雷公藤內酯醇(純度為99.8%，批號070929，福建省醫學科學研究所，溶于4%丙二醇溶液中，經200目過濾器濾過除菌后備用)；兔抗誘導型一氧化氮合酶(iNOS)多克隆抗體(Santa cruz公司)；SP免疫組織化學試劑盒(Zymed公司)；DAB染色試劑盒(北京中杉公司)；江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀(上海川沙花木農機廠)；電腦快速恒溫冷凍切片機(金華市益迪醫療設備廠)；Image-Pro Plus v5.1顯微圖像分析系統(Media Cybernetics公司)；H-600透射電鏡(日立公司)。

1.2動物分組與處理 用無菌生理鹽水將Aβ1～40稀釋成10 μg/μl，37℃孵育1 w，使其變為凝聚態的Aβ1～40。4月齡體質量250～275 g的SD雄性大鼠由南昌大學醫學院實驗動物科學部提供。用Morris水迷宮初篩，去除先天癡呆和游泳姿勢不良者，隨機抽取7只合格大鼠，按照本課題組以往的模型制作法〔3〕給予左側海馬(以Bregma點為0點，AP-3.0 mm，ML 2.0 mm，DV-2.9 mm)一次性注射生理鹽水1 μl，設為對照組。其余合格大鼠給予左側海馬(注射部位同上)一次性注射凝聚態Aβ1～401 μl復制AD模型，在術后1 w進行Morris水迷宮實驗，以對照組大鼠逃避潛伏期均值的95%上限值為標準，將超出上限值者確定為癡呆大鼠。選出造模成功者隨機分為模型組和用藥組，每組7只。用藥組每日腹腔注射雷公藤內酯醇0.4 mg/kg，共15 d，對照組和模型組腹腔注射等容積4%丙二醇溶液。每組5只動物用于免疫組化染色，2只用于電鏡觀察。

1.3免疫組織化學檢測 藥物干預15 d后，每組各取5只動物經左心室插管，生理鹽水沖洗后用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)300 ml灌注，取腦置于上述灌注液中后固定3 h，30%蔗糖浸泡至下沉，在大腦海馬注射區附近連續冠狀冰凍切片，片厚25 μm，進行iNOS免疫組織化學染色。iNOS免疫組織化學染色按SP免疫組織化學試劑盒提供的實驗步驟操作，兔抗iNOS多克隆抗體(1∶100)，DAB顯色，光學顯微鏡下觀察，著棕色的細胞為陽性。陰性對照實驗用PBS代替一抗，重復上述步驟。每個動物取3張切片,每張切片在注射區附近隨機取互不重疊的3個視野,在顯微鏡(×100)下采用Image-Pro Plus v5.1顯微圖像分析系統測出iNOS陽性細胞數和平均光密度。

1.4電鏡觀察 藥物干預15 d后，每組各取2只動物用含4%多聚甲醛·2.5%戊二醛的磷酸緩沖液經左心室灌注固定，參照腦立體定位圖譜在每例大鼠的海馬區注射點附近取1個1 mm3的組織塊，入上述固定液再固定3～4 h，常規包埋、半薄切片，甲苯胺藍染色，光鏡定位后，再做成超薄切片，經醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色，H-600透射電鏡觀察突觸超微結構。

1.5統計學處理 采用SPSS10.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1iNOS免疫組織化學染色 各組大鼠海馬iNOS陽性細胞的表達強度不同。模型組大鼠海馬iNOS陽性細胞數和平均光密度明顯高于對照組(P<0.01)，用藥組大鼠海馬iNOS陽性細胞平均光密度較模型組明顯減少(P<0.05)，但陽性細胞數無明顯改變(表1，圖1)。

表1 各組大鼠海馬iNOS免疫組織化學染色結果±s,n=5)

圖1 各組大鼠海馬iNOS免疫反應陽性細胞(DAB，×100)

2.2電鏡突觸超微結構的改變 透射電鏡結果顯示，對照組大鼠海馬神經氈內突觸結構清晰、數量較多，突觸前囊內可見大量輪廓清晰、圓形透亮的突觸小泡，突觸后膜胞漿面可見電子密度高的突觸后致密物；模型組大鼠海馬神經氈內突觸和突觸小泡數量較對照組減少，突觸后致密物厚度變薄；用藥組大鼠海馬神經氈內突觸和突觸小泡數量較模型組增多，突觸后致密物增厚(圖2)。

圖2 大鼠海馬突觸超微結構

3 討 論

突觸是神經傳輸、加工的樞紐，是受體、通道、功能蛋白的密集之地。突觸可塑性是神經可塑性的最主要形式。大量研究表明，學習記憶能力與中樞神經系統突觸結構可塑性密切相關。突觸結構可塑性主要表現在神經元突觸數量、形態、神經環路等方面的變化〔11〕。Scheff等〔12〕發現，AD患者海馬齒狀回突觸明顯丟失。Alonso-Nanclares等〔13〕的研究顯示，APP/PS1轉基因AD模型小鼠海馬齒狀回突觸數量明顯下降。Li等〔14〕發現，快速老化模型小鼠海馬CA1區突觸密度、表面積密度和突觸后致密物厚度明顯減少。趙唯賢等〔15〕發現模型組海馬CA1區突觸密度降低，突觸間隙變小，突觸小泡數量減少。本實驗結果和上述文獻均提示AD腦內突觸結構受損，但其病理機制尚未完全明了。研究表明，Aβ可激活小膠質細胞釋放細胞因子、NO、超氧化物等炎性介質，使Tau蛋白磷酸化，引起細胞骨架重組，阻礙正常微管聚集和軸突穩定，導致突觸蛋白和突觸丟失〔16〕；AD腦內活化的小膠質細胞可激活補體系統，誘導突觸和樹突棘的丟失〔17〕；AD腦內的慢性炎癥反應可抑制突觸傳遞可塑性的重要指標長時程增強〔18〕。因此，我們認為AD突觸結構受損可能與其腦內的慢性免疫炎癥反應有關。

雷公藤內酯醇是從雷公藤中提取出來的環氧化二萜內酯類化合物，具有較強的抗炎、免疫抑制作用，在治療類風濕關節炎、紅斑狼瘡、腎臟疾病等自身免疫性炎癥性疾病方面已經取得了較好療效〔19〕。由于AD腦內的免疫炎癥病理，雷公藤內酯醇有可能通過抗炎、免疫抑制機制對AD進行干預。雷德亮等〔20〕發現雷公藤內酯醇能抑制APP/PS1轉基因AD模型小鼠海馬內Aβ沉積和老年斑形成。顧明等〔21〕發現雷公藤內酯醇對Aβ1～42所誘導的PC12細胞凋亡有抑制作用。陳龍飛等〔10〕發現雷公藤氯內酯醇(雷公藤內酯醇的衍生物)可以抑制Aβ1～40誘導的iNOS 表達和NO 產生。我們的前期工作表明，雷公藤內酯醇可以改善AD模型大鼠的學習記憶能力，抑制AD模型大鼠海馬NF-κB的活化〔3〕，減少神經細胞的凋亡〔22〕。結合上述文獻資料，我們認為，雷公藤內酯醇對AD具有明確的神經保護作用，這種神經保護作用可能與其抑制AD腦內的慢性免疫炎癥反應有關。

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