高糖對體外培養的視網膜Müller細胞增殖及細胞信號傳導網絡的影響

孫雅彬 王大廣 宋 鄂 葉 飛 張 泳 孫雅敏 徐越超

(吉林大學第一醫院眼科，吉林 長春 130021)

糖尿病性視網膜病變(DR)是正處在工作年齡的成年人失明的一個重要原因〔1,2〕。在視網膜中Müller細胞與葡萄糖的代謝關系極其密切，它可以優先攝取葡萄糖，通過糖原代謝、有氧及無氧糖酵解為內層其他細胞供能，并且Müller細胞的突起包繞在視網膜的神經元及血管周圍，與視網膜神經細胞及視網膜血管發生多種功能的交互作用。在高糖等病理條件下，Müller細胞可以通過生理的和生物合成的變化，影響視網膜內層細胞的代謝活動，干擾視網膜神經細胞和血管的正常功能〔3～6〕。本文通過檢測不同葡萄糖濃度培養的視網膜Müller細胞增殖情況，了解高糖對Müller細胞增殖的影響，并且通過PPA技術檢測高糖與正常血糖濃度下Müller細胞中蛋白質的表達情況，分析差異表達的蛋白質，明確高糖培養的視網膜Müller細胞的蛋白質表達特征。

1 材料與方法

1.1化學藥品 無血清DMEM加入葡萄糖(Fisher Scientific公司, 美國Fair Lawn))至終濃度為5，10， 25，50 mmol/L。

1.2大鼠視網膜Müller 細胞培養與鑒定 按照我們以往實驗的方法進行大鼠視網膜Müller 細胞培養與鑒定〔7〕。

1.3細胞增殖 MTT法用以檢測高糖引起的Müller 增殖。第三代Müller 細胞接種于96孔板，每空細胞數約為5×103，無血清DMEM內孵育24 h。更換為高糖條件液再次孵育72 h。 然后每孔加入5 mg/ml 的MTT 10 μl再次孵育3 h。去掉上清液，每孔加入100 μl DMSO，用ELx800(Bio-Tek Instruments公司，美國 Winooski)分光光度儀，波長570 nm測量每孔的光度值。

1.4Protein pathway array Müller 細胞(1×106) 于10 cm培養皿內無血清DMEM培養24 h。然后細胞更換培養液為50 mmol/L葡萄糖培養72 h。用1倍細胞裂解液(Cell Signaling Technology公司，美國Danvers),包含20 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L EGTA，1% Triton，2.5 mmol/L焦磷酸鈉，1 mmol/L β-甘油磷酸鈉，1 mmol/L Na3VO4和1 μg/ml亮抑蛋白酶肽，提取細胞總蛋白。 每個培養皿中加入300 μl裂解液，用細胞刮板刮除培養皿表面的單層細胞。細胞裂解產物超聲裂解15 s，2次，14 000 r/min，4℃，離心30 min。BCA蛋白質分析試劑盒(Pierce公司，美國Rockford)檢測蛋白質濃度。按前文所描述〔8〕，進行PPA流程。

1.5信號傳導網絡分析 應用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)，一種基于互聯網的信號通路分析軟件，進行蛋白質之間生物功能的關聯性分析。 將PPA中檢測到的表達有顯著差異(P<0.05)的蛋白質輸入IPA軟件，進行經典信號傳導通路的功能性分析。以IPA軟件內已知文獻中各基因或蛋白質的相互作用為基礎，將所輸入蛋白質之間的直接或間接的作用進行分析，并最終構建出新的信號通路。應用數據庫內的基因功能性分析，還能夠分析出所輸入蛋白質與哪些已知疾病的最具有關聯性，并且應用Fisher精確檢驗計算P值。蛋白質在分析結果中被表示為“節點”，每兩個“節點”之間的關系由一條直線表示，每條直線至少有一篇參考文獻支持。

2 結 果

2.1高糖刺激Müller 細胞增殖 孵育72 h后，Müller細胞的增長呈葡萄糖濃度依賴性(50 mmol/L葡萄糖濃度增殖最強)。

2.2高糖條件下Müller細胞中的差異表達蛋白 根據配對t檢驗(P<0.05)和倍數變化值(>1.5)結果，在這些表達的蛋白質中，有47種蛋白質在正常葡萄糖濃度和高糖兩組間表達量有顯著性差異。其中40種蛋白質在高糖條件下高表達，包括VEGF (10.58 倍)，XIAP (3.33 倍)，Cyclin E (9.02 倍)，Nkx-3.1(8.76 倍)，PDEF (6.03 倍)，TNF-α(5.70 倍)，NFκB p65(4.24 倍)，IL-1β (5.49 倍)，Cdk4(5.48 倍)，p-PKC-α/βⅡ(5.46 倍)，NFκB p50(5.21 倍)，Bax (5.01 倍)，p38 (4.96 倍)，cdk2 p34(4.14 倍)，p-PKC-α(4.02 倍)，Cyclin B1(3.95 倍)，Cdk6(3.73 倍)，Cdk2(3.64 倍)，p-PTEN(3.56 倍)，Cyclin D1(3.38 倍)，Cdc25B(3.29 倍)，PTEN(2.98 倍)，Cdc25C(2.90 倍)，HIF-1α(2.59 倍)，ERK(2.55 倍)，p-Stat3(2.41 倍)，HIF-3α(2.40 倍)，p27(2.35 倍)，Bcl-6(2.30 倍)，Bcl-xL(1.89 倍)，uPA(1.54 倍)和p-AKT(1.53 倍)；其中7種蛋白質在高糖條件下表達下調，包括 p-GSK-3a/β(-9.24 倍)，p-p53(-7.35)，Erα(-4.56 倍)，KAI1(-3.53 倍)和RIP(-2.36 倍)?；贗PA結果，這47種蛋白質參與了幾條重要的信號傳導通路，包括XIAP/Apoptosis信號通路(p-p53, NFκB p65, p38, Bax, NFκB p50, c-IAP2, TNF-α, Bak, XIAP)，PI3K/AKT 信號通路(p-p53, NFκB p65, p-Akt, p38, 14-3-3 β, Hsp90, p-GSK-3α/β, NFκB p50, Cyclin D1, PTEN)，ILK信號通路(VEGF, NFκB p65, p-Akt, p38, p-GSK-3α/β, HIF-1α, NFκB p50, Cyclin D1, TNF-α, PTEN)，PTEN信號通路(NFκB p65, p-Akt, p-p38, p-GSK-3α/β, NFκB p50, Cyclin D1, Bcl-xL, PTEN)，細胞周期：G1/S 節點調控信號通路(p-p53, p-RB, Cyclin E, Cdk4, Cdk6, Cyclin D1, Cdc2 p34)，HIF-1α信號通路(VEGF, Epo, p-p53, p-Akt, p38, Hsp90, HIF-1α)，細胞周期：G2/M 節點調控信號通路(Cdc25B, p-p53, Cdc25C and Cyclin B1, 14-3-3 β)，HGF信號通路(p-Akt, p-p38, p-Stat3, Cyclin D1, Cdc2 p34)，糖尿病信號通路(NFκB p65, p-Akt, p38, NFκB p50, TNF-α)，NFκB 信號通路(NFκB p65, p-Akt, RIP, IL-1β, NFκB p50, TNF-α)，VEGF 信號通路(VEGF, p-Akt, p38, HIF-1α)，ERK/MAPK信號通路(p38, p-GSK-3α/β, p-Stat3)和胰島素受體信號通路(p-Akt, p38, p-GSK-3α/β, PTEN)。這些結果提示高糖可以引起 Müller 細胞中信號傳導通路改變，這些改變共同促使Müller細胞存活和增殖。

2.3IPA軟件構建出高糖培養的視網膜Müller細胞差異表達蛋白質關系圖 將PPA結果所篩選的47種差異表達蛋白質輸入IPA信號通路軟件進行分析，構建出這些蛋白質之間的相互作用關系圖(圖1)。

圖1 高糖誘導的Müller細胞中差異表達蛋白的信號網絡關系

3 討 論

在糖尿病患者眼內Müller細胞表現為膠質細胞增生，細胞數量增多〔9〕。神經膠質增生出現在血腦屏障破壞之后，這樣就進一步加重了血管功能障礙。神經膠質增生可能是由氧化應激以及多元醇通道的激活引起，因為這些通道的藥理激活抑制了膠質纖維酸性蛋白的上調。糖尿病患者以及動物模型的Müller細胞的數量都增加了并且Müller細胞也被激活了，這體現在膠質纖維酸性蛋白(GFAF)以及巢蛋白的表達上調〔10〕。

Müller細胞會釋放血管生成因子以及神經元營養因子以保護視網膜免受高血糖癥誘導應力并最終對DR的發病機制做出貢獻。VEGF是從DR早期的Müller細胞中釋放出來的〔11〕，并且通過局部增加血管的滲透性來提高灌注，同時抗血管生成的PEDF也減少了〔12〕。VEGF以及其他的分泌因子，如堿性成纖維細胞生長因子，也是神經營養的，而且它們可能會保護神經元免受高血糖誘發的氧化應激〔13〕。目前尚不清楚血管生成因子的作用是否支持糖尿病視網膜中的應力神經元或是增加閉塞血管的滲透性。慢性暴露于這些因子會導致一個兩相的視網膜反應，而且增加的滲透性會促進應力因子的進一步滲透并最終釋放更多的滲透因子從而形成一個有害的正回饋循環。這樣就行成了糖尿病黃斑水腫，而且它是患有DR患者失明的一個主要原因〔14〕。在糖尿病患者以及動物模型的玻璃體以及視網膜中已經檢測到VEGF〔15,16〕。此外，VEGF以及PEDF的眼內層能夠對非增殖期DR向增殖期DR的轉變做出預測〔14〕。同樣地，對VEGF的抑制會阻止患有糖尿病動物的血視網膜屏障的衰退而且在臨床上已經開始血管內皮生長因子抗體的作用來治療糖尿病黃斑水腫以及增殖期DR〔17,18〕。

膠質激活可能會導致與DR進程相關的炎癥。Müller細胞、小神經膠質細胞或者是滲透到視網膜的白細胞都可以分泌細胞因子〔19〕?；钚匝跻约巴砥谔腔K末產物的受體都已經在Müller細胞上得到表達，而且它們對于DR的發病機制都是非常重要的，因為氨基胍治療會抑制DR在動物模型的發展〔20〕。誘生型氮氧合酶的數量在糖尿病人類患者以及動物模型都增加了而且它和VEGF超表達一樣都位于Müller細胞，而且它還可能與糖尿病中血視網膜屏障破壞有關〔21〕。

我們的實驗結果清晰的顯示，高糖可以刺激Müller細胞增殖，這種增殖作用是Müller細胞中幾條重要的信號傳導通路共同參與的結果，并且 PPA結果 和IPA 軟件分析證實高糖影響了細胞內許多經典信號傳導通路，包括 XIAP/凋亡信號通路，VEGF 信號通路和細胞循環調控通路等。這些信號傳導通路的變化可以減少Müller 凋亡，促進細胞存活，為DR的發病機制研究提供新的依據。

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