益氣溫陽活血方含藥血清對大鼠肥大心肌細胞原癌基因c-fos、c-myc表達的影響

李春陵 顧廣富 羅建華 楊冬花

(貴州省人民醫院干醫科，貴州 貴陽 50002)

持續的交感神經過度激活是慢性心力衰竭的重要特征，也是心室重塑和病情惡化的重要促進因子〔1〕。c-fos、c-myc是調控細胞增殖的相關原癌基因，通過調控肥大晚期基因的表達，導致心肌細胞蛋白質合成增加，蛋白表型向胚胎型轉化〔2〕。益氣溫陽活血方在心力衰竭早期可通過PPARγ信號通路調節血管緊張素(Ang)Ⅱ、醛固酮的表達，防止心室重塑，改善心臟功能〔3〕，但是否能通過抑制c-fos、c-myc的表達防止心室重塑，目前尚不清楚。本研究益氣溫陽活血方對肥大心肌細胞c-fos、c-myc表達的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 健康Wistar大鼠30只，體重(250±10)g，雌雄各半；Wistar乳鼠40只，新生2 d左右，雌雄不拘，由貴陽醫學院實驗動物學部提供。

1.2益氣溫陽活血方組成 人參30 g，黃芪30 g，桂枝9 g，丹參30 g，益母草30 g，紅花6 g，白術15 g，澤瀉9 g，茯苓15 g，葶藶子9 g，炙甘草6 g等11味中藥，藥材從貴州省人民醫院中藥房一次性選購，生藥按比例取好，加水浸泡1 h，第1遍煮沸40 min，濾渣取汁，再加水煮沸15 min，濾渣取汁，合并2次煎液，在水浴中濃縮至每毫升煎液含生藥4 g，保存備用。

1.3試劑 卡維地洛(齊魯制藥有限公司，批號：H20000100)，胎牛血清(GIBCO公司)，AngⅡ(Sigma公司)，1640培養基、胰酶(Sigma公司)，大鼠Anti-c-fos抗體、大鼠Anti-c-myc抗體(Santa Cruz公司)，ECL顯影試劑盒(Santa Cruz 公司)，AD、NE(IBL公司)，制膠、電泳及轉膜儀(Bio-Rad公司)。

1.4含藥血清制備 大鼠分為中藥組10只，予益氣溫陽活血方(8 ml/kg)灌胃治療；卡維地洛組10只，予卡維地洛(50 mg·kg-1·8 ml-1蒸餾水)灌胃治療；空白血清組10只，予蒸餾水(8 ml/kg)灌胃。均每日給藥2次，共8 w。末次灌胃后1 h頸動脈采血處死動物，分離血清。將血清經微孔濾膜滅活、濾菌后與DMEM培養基配成10%濃度。

1.5肥大心肌細胞模型 取新生乳鼠心室肌，用0.25%胰蛋白酶消化分離，經差速純化2 h，將接種于10%血清DMEM培養液中。取上述細胞加入AngⅡ(終濃度10-7mol/L)作用48 h誘導心肌肥大。

1.6實驗分組及處理 正常組正常心肌細胞加空白血清培養。模型組肥大心肌細胞加空白血清培養。中藥組和西藥組肥大心肌細胞加益氣溫陽活血方、卡維地洛含藥血清培養。

1.7心肌細胞蛋白含量測定 吸去培養板各孔中的培養液，用D-Hanks 液快速沖洗3次后，加入1% SDS 0.5 ml溶解細胞，根據計數，每孔細胞數約為5×105個，Lowrys 法測每孔細胞蛋白質含量。

1.8心肌細胞體積測量 用D-Hanks液快速沖洗長滿細胞的培養孔3次，每孔加0.3 ml 0.1%的胰蛋白酶，放入37℃恒溫箱中30 min后，再加入0.2 ml含有10%血清的培養基終止消化，收集細胞注入一細胞室內，在400倍的倒置顯微鏡下觀察其中的細胞。用計算機CIAS大恒細胞圖像分析系統測量單個細胞直徑，計算細胞的體積。每孔隨機選擇4個視野，每個視野測20個細胞。

1.9檢測細胞上清AD、NE含量 以酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測，操作過程參照試劑盒說明進行。

1.10肥大心肌c-fos、c-myc蛋白質的表達 提取心肌細胞蛋白質，制備聚丙烯酰胺凝膠、蛋白電泳、轉膜。一抗濃度均為1∶1 000，二抗濃度為1∶2 000，化學發光試劑法曝光、顯影和定影，凝膠成像分析系統進行密度掃描并分析。

1.11統計學處理 采用SPSS11.0軟件行單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

模型組心肌細胞蛋白含量、心肌細胞體積及細胞上清AD、NE含量、c-fos、c-myc蛋白質表達水平與正常組、中藥組、西藥組比較均明顯升高(P<0.05)。中藥組、西藥組心肌細胞蛋白含量、心肌細胞體積及細胞上清AD、NE含量、c-fos、c-myc蛋白質表達水平與正常組均無顯著性差異(P>0.05)。見表1。心肌細胞c-fos、c-myc蛋白質表達水平的聚丙烯酰胺凝膠蛋白質電泳圖見圖1。

表1 各組心肌細胞蛋白含量、心肌細胞體積及細胞上清AD、NE含量、c-fos、c-myc蛋白質表達水平±s,n=10)

圖1 c-fos和c-myc蛋白質的表達

3 討 論

目前，由AngⅡ誘導的乳大鼠心肌細胞肥大模型是常用的實驗模型，是研究心室重塑發生機制的理想方法，也是篩選和評價抗心肌肥大新藥的常用方法之一。心肌肥大主要是指心肌細胞體積增大、重量增加而無細胞分裂，表現為：心肌細胞體積增大、蛋白質蓄積、肌原纖維新形成的肌節增加〔4〕，本研究結果顯示：由AngⅡ誘導的乳大鼠心肌細胞的蛋白含量、體積明顯高于正常心肌細胞。

c-fos、c-myc是調控細胞增殖的相關原癌基因，其編碼的核蛋白作為反式作用因子，通過激活某些基因的轉錄而參與細胞增殖信號的傳遞，可調控影響細胞生長、分化基因的表達〔5〕。研究發現，將AngⅡ加入心肌細胞培養液中，心肌細胞原癌基因c-fos表達迅速加強，蛋白質合成速率明顯增加，心肌細胞出現明顯肥大〔6〕。在充血性心力衰竭中，由于c-myc的過表達，可導致一些心肌肥大信號通路的活化，從而出現心臟功能失調、心肌壞死〔7〕。

交感神經系統激活是慢性心力衰竭最快速最早期的代償機制之一。在心力衰竭早期，兒茶酚胺濃度明顯升高，NE釋放，作用于β腎上腺受體，提高心肌收縮力、心率，從而增加心排血量〔1〕。但長時間交感神經系統的高度激活對心臟本身和心功能均產生不利影響，可增加心肌耗氧量，特別是NE對心肌細胞有直接的毒性作用，促使心肌細胞凋亡，參與心室重塑的病理過程〔8〕。慢性心力衰竭時β腎上腺受體的激活程度決定了心力衰竭的發生及發展。研究表明，在心力衰竭心肌中，β3腎上腺受體的mRNA和蛋白質表達出現明顯上調，且表達持續升高，隨著心力衰竭加重，β3腎上腺受體的表達與左心室功能高度相關〔9，10〕。

導致心肌肥大可分3個環節：胞外肥大刺激信號、胞內信號傳導及核內基因轉錄活化，最終誘導細胞發生肥大表型變化〔11〕。Ca2+是心肌細胞內最重要的第二信使，心力衰竭時β3腎上腺受體興奮，使靜息心肌細胞〔Ca2+〕i升高〔12〕，活化鈣調磷酸神經激酶-活化的T細胞核因子3信號通路，激活第三信使c-myc、c-fos等原癌基因〔13〕，作用于次級反應基因心房利鈉因子、AngⅡ等〔14，15〕，使心肌細胞向胚胎化發展，引起心肌蛋白質合成，細胞體積增加，心肌間質細胞增殖，促進膠原合成和分泌。

交感神經系統激活β受體介導的心室重塑是心力衰竭發生與發展的主要病理生理機制，也構成了β受體阻滯劑治療慢性心力衰竭的基石作用。近年來，眾多臨床試驗已經證實了β受體阻滯劑對于心力衰竭的治療作用，主要通過對交感神經激活的抑制，來改善患者心室重塑和心功能。具有與β受體阻滯劑——卡維地洛相同的作用。推測該方防止心肌肥大的機制，可能是通過對交感神經興奮的抑制，阻斷β3腎上腺受體持續激活，抑制鈣調磷酸神經激酶-活化的T細胞核因子3信號通路的活化，減少核內c-myc、c-fos等原癌基因的激活表達，從而阻斷心肌肥大信號對下游的傳遞，避免心肌細胞向胚胎化發展而實現的。具體作用機制有待進一步研究。

4 參考文獻

1劉曉莉，肖培林，殷躍輝.經導管消融選擇性去腎交感神經治療——未來心力衰竭治療的熱點〔J〕.心血管病學進展，2013；34(3)：378-81.

2江鳳林，馮 俊，鄭 智.丹參酮ⅡA對AngⅡ誘導的心肌肥大中c-fos、c-myc和c-jun mRNA表達的影響〔J〕.中國藥理學通報，2007；23(1)：55-9.

3楊冬花，付 蓉，羅建華，等.益氣溫陽活血方對早期心力衰竭大鼠血管緊張素Ⅱ和醛固酮的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(7)：2472-4.

4楊光宇，王洪新，趙素玲，等.黃芪甲苷對血管緊張素Ⅱ誘導大鼠心肌細胞肥大的抑制作用〔J〕.中藥藥理與臨床，2013；29(3)：28-31.

5文婷婷，陳 萍.原癌基因致急性心肌梗死后心室重構的研究進展〔J〕.國際麻醉學與復蘇雜志，2010；31(3)：248-57.

6周代星，梁黔生，何雪心，等.AngⅡ誘導的心肌肥大中c-fos，c-jun mRNA表達變化及丹參酮ⅡA 的影響〔J〕.中國中藥雜志，2008；33(8)：936-9.

7Chen HB，Wang L，Jiang JF.Re-analysis of expression profiles for revealing new potential candidate genes of heart failure〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013；17(7)：903-11.

8葛均波，徐永建.內科學〔M〕.第8版.北京：人民衛生出版社，2013：165.

9冷曉寧，賈 靜，王蕾紅，等.心衰大鼠心肌β3腎上腺素能受體和內皮型一氧化氮合酶的表達〔J〕.哈爾濱醫科大學學報，2012；46(2)：99-103.

10陳 哲，安慧玲，陳枚潔，等.心力衰竭大鼠增齡過程中β3腎上腺素能受體異常表達的研究〔J〕.中華臨床醫師雜志( 電子版)，2013；7(7)：3019-23.

11王桂君，郭蓮怡，王洪新.鈣離子在腫瘤壞死因子α 誘導心肌肥大中的作用〔J〕.中國動脈硬化雜志，2013；21(1)：47-51.

12鄧義軍，伍 衛，方 昶，等.β3-腎上腺素能受體對心力衰竭大鼠心室肌細胞內靜息Ca2+濃度的調控及其轉導途徑〔J〕.南方醫科大學學報，2009；29(8)：1635-40.

13楊永健，張 鑫，速曉華.β腎上腺素受體信號相關通路參與心功能不全患者心肌重構的機制〔J〕.心臟雜志，2008；20(1)：37-44.

14趙育潔，秦志平，劉宗芳.培哚普利對急性心肌梗死后大鼠心肌組織中AngⅡ、ERK1/2、c-fos mRNA含量的影響〔J〕.鄭州大學學報 (醫學版 )，2008；43(1)：146-9.

15劉軍翔，宋冬林，張方寧.復合離子鹽對兩腎一夾高血壓大鼠左心室心肌肥厚和纖維化的影響及其機制的初步探討〔J〕.臨床薈萃，2011；26(7)：597-601.