microRNA在兩種不同來源的肝卵圓細胞中的差異表達

許榮華 何冬雷 孟 津 夏立平 王 健

(海南醫學院附屬醫院胃腸腫瘤外科，海南 海口 570102)

有研究表明微小RNA(miRNA)與干細胞的自我更新、多能性的維持、分化和分裂增殖等過程有關〔1，2〕。臨床研究發現: 在肝臟損傷、肝硬化、肝細胞癌(HCC)這一遞進式過程中,卵圓細胞大量增殖并參與肝臟損傷的修復，是否說明卵圓細胞與肝癌細胞間有必然的聯系，多數學者認為肝內卵圓細胞(HOCs)為HCC的起源細胞〔3〕，且國內有研究證明使用3′-甲基-4-二甲基偶氮苯(3′-Me-DAB)所得的卵圓細胞與肝癌的發生有著密切的聯系〔4〕。本研究采用哺乳動物miRNA表達譜芯片技術檢測兩種不同模型來源的大鼠肝卵圓細胞的miRNA，篩選出兩種不同來源的卵圓細胞的差異表達miRNA，以發現可能參與調控卵圓細胞分化為肝癌細胞的相關microRNA, 從而為闡明并掌控卵圓細胞向肝癌細胞分化的microRNA調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級健康的雄性Wistar 大鼠40只,體重(120±20)g,由南方醫科大學實驗動物中心提供(動物合格證號：2002-2009，2004B023，2004A068),大鼠按標準實驗室動物要求, 正常飼料喂養。

1.2試劑 2- 乙酰氨基芴(AAF)、表皮生長因子(EGF)、DMEM高糖、DMEM/F12 培養基和膠原酶Ⅳ均購自美國Sigma 公司，干細胞因子(SCF)、肝細胞生長因子(HGF)和白血病抑制因子(LIF) 購自Cytolab/Peprotech Asia 公司。3′-Me-DAB(日本東京化成工業株氏會社),小鼠抗大鼠c-kit單克隆抗體、Thy-1單克隆抗體(Santa Cruz, USA), FITC 標記山羊抗小鼠Ig 抗體為北京中杉金橋生物技術有限公司提供,胎牛血清、F12、Hank液、PBS(廣州威佳責任有限公司)。 mirVanaTM miRNA Isolation Kit(Ambion, USA)，miRNA Complete Labeling and Hyb Kit(Agilent)。DNA抽提試劑盒、Taq DNA聚合酶(1.667×108nkat/L)( 北京鼎國生物技術有限責任公司)。

1.3大鼠HOCs增殖模型的建立 HOCs/AAF增殖模型：取20只♂Wistar大鼠穩定飼養1 w后，將AAF 溶于植物油中，每日下午灌胃1 次，按20 mg·kg-1·d-1連續喂養6 d。第7天在乙醚持續吸入麻醉下施行左肝切除術或2/3肝切除術。第8天繼續喂養AAF(劑量同術前)，至第14天結束，然后于術后第12天在全麻下再次經上腹正中切口入腹，迅速切取剩余肝臟，放人冰D-Hank 液中漂洗備用。參照文獻〔5〕，用眼科剪剪碎肝組織成0.1 cm2見方組織塊，冰D-Hank 液洗后，將肝組織放入2 ml含0.10% 膠原酶Ⅳ 和0.025%EDTA 的DMEM培養基，繼續剪碎肝組織，倒入50 ml三角燒杯。加上述消化液8 ml，在37℃水浴振洗15 min，100目濾器過濾，殘存組織按上述消化過程重復進行1、2次。細胞懸液4℃離心5 min。上清液經4℃離心10 min。沉淀的細胞用2 ml DMEM 培養基懸浮，加入50 ml含0.10% Pronase E 和0.005% DNase I 的DMEM 培養基，37℃、5%CO2培養30 min。細胞懸液4℃離心10 min。細胞用2 ml D-Hank液懸浮。參照Sirica等〔6〕介紹的Percoll 密度梯度離心法進行HOCs分離。2 ml DMEM懸浮細胞,接種于含20%小牛血清、20 g/mlEGF及各種氨基酸的DMEM/F12培養液。在37℃、50 ml/L CO2孵箱中培養〔7〕。

HOCs/DAB 增殖模型：20只Wistar 大鼠穩定飼養1 w后, 改喂含0.06% 3′-Me-DAB的飼料，飼養溫度28℃, 濕度40%～70%。4 w后切除肝臟提取分離HOCs，步驟同上。

新分離的HOCs/AAF和HOCs/DAB細胞用0.25%臺盼藍染色觀察細胞活力并進行干細胞表面標志鑒定。臺盼藍染色細胞活力達95%。調整細胞濃度為5×105/ml，接種于血清培養基。

1.4HOCs的鑒定和惡性分化 ①激光共聚焦掃描顯微鏡(LSCM)觀察:細胞爬片,0.01 mol/L PBS 漂洗1 min×3,4℃下4%PFA 固定15 min , 0.01 mol/L PBS 漂洗3 min×3;加入一抗(小鼠抗大鼠Thy-1單抗和C-kit 單抗) ,4℃過夜,洗滌5 min×4,移入適當稀釋度的熒光素FITC標記抗體二抗, 4℃孵育數小時,避光洗滌5 min×4,室溫下封片,避光保存。在LSCM下進行熒光素抗體標記的圖像采集、合并和分析,激發波長為488 nm,發射波長為504 nm。胞質和胞膜呈綠色為陽性。②前10代每2代觀察一次，自第10代開始，每5代觀察一次，并提取miRNA。

1.5基因芯片檢測 取生長良好的HOCs/DAB與HOCs/AAF細胞提取總RNA，并對RNA進行濃縮、定量、質檢。用PEG 方法對miRNA 進行分離。采用美國 Affymetrix 的 GeneChip miRNA 2.0Array(miRNA定量平臺)進行miRNA表達譜分析：選擇FlashTag Biotin RNA Labeling Kit(美國Genisphere公司)對1 μg miRNA 進行生物素標記，隨后按照 Affymetrix 的操作說明(Fluidics Protocol FS450_0003)進行芯片雜交、洗脫、圖像掃描及數據標準化。判斷miRNA差異表達的篩選標準: 耐藥細胞組與親本細胞組的檢測結果比值>1.5(上調1.5倍)或<0.67(下調1.5倍)，認為miRNA再耐藥株與親本細胞之間有差異性表達；如差異倍數>2.0 或<0.5，認為miRNA表達差異顯著。

1.6實時熒光定量PCR 采用TRIzol一步法提取HOCs/AAF和HOCs/DAB細胞的RNA, 具體步驟見Invitrogen公司的操作法。以1 μg總RNA進行逆轉錄合成cDNA, 操作步驟見Fermentas公司的逆轉錄體系配置法。將逆轉錄后的產物cDNA，進行實時熒光定量PCR，采用Bio-toyobo公司的SYBR Green實時定量PCR試劑盒，進行兩步法擴增，10 μl反應體系：2×SYBR Real-time PCR Premixture 5 μl，正向引物0.3 μl(300 nm)，反向引物0.3 μl(300 nm)，cDNA 2 μl，雙蒸水2.4 μl。反應條件：退火溫度60℃；95℃變性2 min；95℃，15 s，55℃，30 s。重復40個循環。65℃～95℃繪制溶解曲線。 microRNA引物直接采用贏潤生物的miRNA引物套裝，根據擴增的目的miRNA和管家基因U6的Ct值，計算出擴增的目的miRNA相對于管家基因U6的變化倍數。兩株細胞擴增的目的miRNA相對于管家基因U6的變化倍數之比即是相對定量的結果。

2 結 果

2.1激光共聚焦掃描顯微鏡結果 HOCs胞質和胞膜表達干細胞標志物Thy-1及C-kit(見圖1)。

Thy-1 C-kit

2.2HOCs的生長速度及倍增時間 HOCs呈多角型, 橢圓形或圓形。在體外培養傳代后, 繁殖速度加快, 細胞質逐漸增多，并分化為圓形的肝癌細胞和細長紡錘樣膽管細胞。細胞的群體倍增時間逐漸延長。見圖2。

圖2 HOCs細胞生長形態

2.3HOCs/AAF和HOCs/DAB細胞差異表達miRNA 抽提HOCs/AAF和HOCs/DAB細胞中的總RNA，通過紫外分光光度計定量和瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，RNA的A260/280比值介于1.89～2.02，提取的總RNA無明顯降解，條帶清晰，RNA質量符合miRNA 芯片檢測的要求(圖3)。經芯片檢測發現，與HOCs/AAF細胞比較，HOCs/DAB細胞中有23個差異表達的miRNA，其中10個microRNA表達上調，8個microRNA表達下調(見表1)。

圖3 抽提HOCs/DAB和HOCs/AAF細胞總RNA電泳圖

表1HOCs/DAB和HOCs/AAF細胞中差異表達的miRNA

表達上調microRNAHOCs/DABHOCs/AAF表達下調microRNAHOCs/DABHOCs/AAFhsa-mir-3022.79 hsa-mir-1490.636 4hsa-miR-92b1.73 hsa-mir-31950.622 6hsa-mir-12811.70 hsa-mir-210.621 4hsa-mir-18251.65 hsa-mir-7620.615 7hsa-mir-4211.60 hsa-mir-1260b0.610 1hsa-mir-1001.59 hsa-mir-4830.595 7hsa-mir-6151.54 hsa-mir-12280.539 2hsa-mir-2121.53 hsa-mir-1810.528 8hsa-mir-1321.52 hsa-mir-3241.51

圖4 差異miRNAs在HOCs/AAF和HOCs/DAB細胞中的相對表達水平

2.4對芯片篩查差異表達顯著的代表性基因的驗證結果 圖4可見，挑選差異顯著且信號強度較高的miRNA進行熒光定量RT-PCR檢測驗證，包括在HOCs/DAB細胞中表達上調的has-miR-1281、has-miR-92b、has-miR-302和表達下調的has-miR-1228、has-miR-181。采用U6作為內參進行歸一化。每條miRNA重復進行三次熒光定量RT-PCR檢測。熒光定量RT-PCR結果顯示：has-miR-1281，has-miR-92b，has-miR-302在HOCs/DAB細胞中較HOCs/AAF細胞表達上調；has-miR-1228，has-miR-181在HOCs/DAB細胞表達下調，與芯片檢測結果基本一致。

3 討 論

miRNA為22個左右核苷酸的小分子RNA, 具有強大的調控功能, 成為當前研究的熱點。miRNA與目的基因3′非編碼區(3′UTR)結合降解mRNA和抑制其翻譯, 控制著細胞的分化、增殖和凋亡等重要的生命活動, 與腫瘤的發生、發展密切相關〔8，9〕；miRNA在腫瘤干細胞的“干性”相關基因和信號通路調控方面發揮著重要作用, 被稱為Stem Cells miRNAs〔10〕。例如: miR-135a和miR-135b家族在結腸腺瘤和腺癌中表達上升, 他們調控著APC基因的表達, 并參與Wnt信號通路的激活, 在結腸癌干細胞中發揮重要作用〔11〕。let-7在乳腺癌干細胞中表達缺失, 從而導致它負性調控的HMGA2基因高表達, 而后者對于乳腺癌干細胞的自我更新發揮著重要作用〔12〕。miR-34家族在胰腺癌中低表達,通過靶向Bcl-2、HMGA2和Notch等信號通路在胰腺癌干細胞中起抑制作用〔13〕。

雖然缺乏直接的證據，但越來越多的實驗結果支持肝癌起源于肝干細胞“成熟受阻”的觀點。Dumble等〔14〕對敲除p53 基因的小鼠喂缺乏膽堿卻補充乙硫氨酪酸的飲食，從而誘導HOCs大量增生，隨后分離出HOCs進行培養后，將這些細胞接種于裸鼠皮下后長出與HCC相似的腫瘤，并確定其由HOCs分化而來，該細胞種植成瘤實驗提示HOCs可能參與HCC的發生。Grozdanov 等〔15〕報道癌胚蛋白Gpc3 可以作為肝祖細胞的標志物，并通過建立Solt - farber 肝癌模型研究證實肝祖細胞/HOCs與HCC的發生有關。最近研究在HCC組織中具有干細胞特征的EpCAM + 細胞引導了肝癌細胞的生長和轉移，進一步提示肝干細胞與HCC的發生有著密切的聯系〔16〕。

Terris等〔17，18〕發現：在高表達上皮細胞黏附分子EpCAM且甲胎蛋白陽性的癌細胞中，miR-181家族表達上升，而這類細胞通常被認為是HCC的腫瘤干細胞。轉染miR-181后，發現EpCAM表型的癌細胞增多。miR-181能激活腫瘤信號途徑Wnt/β-catenin，并抑制一些促分化分子。調節細胞分化的COX2、GATA6，以及抑制Wnt/β-catenin通路的激酶NLK是miR-181的直接靶點，使它們沉默能導致EpCAM +癌細胞數量增加。這些說明miR-181對維持HCC干細胞EpCAM表型即其“干性”具有重要意義。與我們的研究結果相似，Card 等〔19〕研究也發現，多能性因子 Oct4/Sox2 結合在 miR-302 的啟動子上，可以上調 miR-302 的表達，miR-302 可直接作用于細胞周期調控蛋白 Cyclin D1 和 D2，過表達 miR-302 可使 S期延長，G1期縮短。另有研究發現，miR-92b 可抑制細胞周期抑制因子 p57 的翻譯，促進胚胎干細胞迅速通過G1/S 限制點〔20〕。由此可以推論，干細胞特異性miRNAs可促進干細胞通過G1/S限制點，保持其快速增殖的特性。上述篩選的差異miRNAs可能參與HCC干細胞的“干性”, 有深入研究的價值。

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