瑞芬太尼對小鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護作用

楊劍云 吳 婭 臧 暉 李翠林 金 華

(昆明市婦幼保健院麻醉科，云南 昆明 650031)

瑞芬太尼是一種新型的μ阿片受體激動劑，因其藥效強，起效快，安全可靠，被廣泛應用于圍術期患者的鎮痛、鎮靜和術后止痛。近年的動物實驗研究表明，瑞芬太尼對全腦和局灶性的缺血再灌注損傷具有神經保護作用〔1，2〕。瑞芬太尼能通過抵抗腦缺血再灌注損傷所致的氧化應激和細胞凋亡發揮保護作用，但瑞芬太尼能否通過影響腦缺血再灌注后的炎癥應答過程而起到腦保護作用，目前還不清楚。本實驗觀察瑞芬太尼對小鼠腦缺血再灌注后白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-10、轉化生長因子(TGF)-β1和核轉錄因子(NF)-κB表達變化的影響，以探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 瑞芬太尼購于湖北宜昌人福藥業公司(批號：090910)；MCAO栓線購于北京沙東生物技術有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購于美國Sigma公司；NF-κB p65和Lamin B抗體購于美國Santa Cruz公司。其余藥品和試劑均為國產，分析純。

1.2實驗動物分組及給藥 雄性C57BL/6小鼠72只，隨機分為假手術組、模型組和瑞芬太尼預處理組，每組24只。各組根據不同時間點又分為缺血2 h后再灌注0 h、6 h、12 h、24 h組，每組6只。腦缺血再灌注損傷模型制作之前，瑞芬太尼預處理組通過靜脈輸入瑞芬太尼，每次輸注5 min，連續3次，輸注速率為0.7 μg·kg-1·min-1，容積1 ml/5 min,預處理過程共30 min。模型組小鼠接受生理鹽水灌注，速率、容積及方案與瑞芬太尼預處理組相同，假手術組不進行腦缺血再灌注損傷，其余過程與模型組相同。

1.3動物模型的制作 本實驗采用線栓法制備大腦中動脈阻塞模型，術中以肛溫計監測體溫，并用白熾燈加熱維持肛溫在36 ℃～37 ℃。根據Longa線栓法加以改進〔3〕。采用直徑0.32的栓線，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈后，結扎頸外動脈，在頸外動脈近分叉處剪一切口，從中把栓線送入大腦中動脈起始處，固定栓線，2 h后抽出栓線制備再灌注損傷模型。假手術組只分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，不閉塞大腦中動脈。

1.4神經功能缺損評分 腦缺血再灌注24 h后，采用Longa評分法對各組小鼠進行行為學評分〔3〕。該評分法分為5個等級：0分，正常，無神經功能缺損；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，行走時，向對側轉圈，中度神經功能缺損；3分，行走時，向對側傾倒，重度神經功能缺損；4分，不能自發行走，意識喪失。

1.5梗死體積的計算 小鼠腦缺血再灌注24 h后，斷頭、取腦，將腦組織置于-20 ℃中冷凍20 min后，置于腦切片模具內，從額極開始由前向后間隔2 mm冠狀切取腦組織，置于37 ℃的2%TTC溶液中染色30 min。腦切片排序、拍照并輸入計算機，通過圖像分析系統對切片梗死體積和全腦梗死體積計算，各樣本以腦梗死體積/全腦體積比作為統計數據。

1.6腦組織IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β1的檢測 小鼠腦缺血再灌注0 h、6 h、12 h和24 h后，斷頭開顱取腦，分離缺血側大腦皮層組織。將皮層組織用4 ℃生理鹽水迅速制成1∶9勻漿液，3 000 r/min離心15 min，取上清液,采用ELISA法用于IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β1含量的檢測，操作過程嚴格按照試劑盒說明書(博士德生物工程有限公司，武漢)的要求進行。

1.7蛋白免疫印跡 小鼠腦缺血再灌注24 h后，斷頭開顱取鬧，分離缺血側大腦皮層組織。采用核蛋白與胞質蛋白提取試劑盒(博士德生物工程有限公司，武漢)制備核蛋白提取液，用于NF-κB活性的檢測。具體過程如下：BCA法行蛋白定量分析；配制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳分離后，將蛋白質電轉至PVDF膜中；用10%的脫脂奶4℃封閉過夜。然后分別加入NF-κB p65(1∶500)和Lamin B(1∶1 000)的一抗封閉1 h，TTBS洗膜3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶耦聯的IgG抗體，于室溫輕搖1 h雜交反應，TTBS洗膜6次，每次5 min；加入化學發光底物反應5 min后保鮮膜包裹，暗室內進行X線膠片曝光、顯影和定影。

1.8統計學處理 采用SPSS15.0統計軟件進行方差分析、配對t檢驗。

2 結 果

2.1瑞芬太尼改善腦缺血再灌注損傷所致的神經功能障礙 與假手術組(0分)比較，腦缺血再灌注24 h后，模型組〔(3.10±0.45)分〕小鼠的神經功能缺損嚴重(P>0.05)；瑞芬太尼預處理組〔(2.71±0.44)分〕可以顯著地改善腦缺血再灌注損傷所致的神經功能障礙(P<0.05)。

2.2瑞芬太尼減少腦梗死灶體積 與假手術組(0)相比，腦缺血再灌注24 h后，模型組(30.9%±1.8%)小鼠梗死灶體積顯著地增加(P<0.05)；而與模型組比較，瑞芬太尼預處理組(19.8%±2.0%)可以顯著地縮小腦缺血再灌注所致的梗死灶體積(P<0.05)。

2.3瑞芬太尼阻止NF-κB的活化 與假手術組相比，模型組小鼠腦缺血再灌注24 h后，NF-κB的活性增強。而瑞芬太尼預處理組可以抑制NF-κB的活性。見圖1。

圖1 瑞芬太尼對缺血側皮層組織細胞核內NF-κB水平的影響

2.4瑞芬太尼降低促炎癥細胞因子的表達 模型組小鼠在腦缺血再灌注0 h和6 h后，缺血側皮層組織中IL-1β和TNF-α的表達水平顯著增加(P<0.05)；在腦缺血再灌注12 h后，IL-1β和TNF-α的表達水平開始下降。而與模型相比，瑞芬太尼預處理組可以顯著減低缺血側皮層組織中IL-1β和TNF-α的表達水平(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠缺血側皮層組織不同時刻IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β±s,n=6,pg/mg)

2.5瑞芬太尼增加抗炎癥細胞因子的表達 模型組小鼠在腦缺血再灌注0、6、12和24 h后，缺血側皮層組織中IL-10和 TGF-β1的表達水平顯著增加，并都在6 h達到最高水平。與模型組相比，瑞芬太尼預處理組可以顯著增加缺血側皮層組織中IL-10和 TGF-β1的表達水平(P<0.05)。見表1。

3 討 論

阿片受體是一種G蛋白耦聯受體，其在人體內廣泛存在，具有多種生物學活性。近年研究發現，阿片受體具有腦保護作用，能抵抗臟器缺血再灌注損傷〔4～6〕。阿片受體主要有四種類型：δ、μ、κ和孤啡肽受體。近年研究發現，μ型阿片受體具有抗炎癥作用〔7〕。瑞芬太尼作為一種新型的μ阿片受體激動劑，廣泛用于臨床的麻醉。已有研究結果表明，瑞芬太尼對腦缺血再灌注損傷具有抵抗作用。但對其保護機制目前還不清楚。在本實驗中，瑞芬太尼能通過抵抗炎癥反應改善小鼠腦缺血再灌注損傷所致的行為障礙，減少腦梗死體積。

炎癥反應是腦缺血再灌注損傷的重要原因之一〔8〕。腦缺血時血液炎癥細胞會向腦內浸潤，膠質細胞會被激活，引發腦組織炎癥反應的失控，加重腦缺血再灌注損傷〔9〕。細胞因子在腦缺血的炎癥應答過程中扮演著十分重要的作用。腦缺血會導致IL-1β和TNF-α等促炎癥因子的表達上調〔9～11〕。在短暫性局部腦缺血模型中IL-1β和TNF-α的表達被上調，并在再灌注數小時內達到頂峰。IL-1β和TNF-α對腦缺血時嗜中性粒細胞的浸潤和膠質細胞的激活起著十分關鍵的作用，IL-1β或TNF-α的抑制劑可以緩解腦缺血損傷〔12，13〕。腦缺血后炎癥應答過程所致的損傷程度主要取決于促炎癥因子的級聯反應和抗炎癥因子的誘導作用。抗炎癥因子IL-10和 TGF-β1對緩解腦缺血再灌注損傷具有重要的調控作用，外源性IL-10和 TGF-β1的給予可以抵抗腦缺血再灌注損傷〔14～17〕。研究證實，IL-10能抑制促炎癥因子的產生〔18〕。本實驗中，瑞芬太尼能顯著地上調抗炎癥因子IL-10和 TGF-β1的表達，并抑制促炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達，推測瑞芬太尼可能通過抑制炎癥反應過程，阻止嗜中性粒細胞的浸潤和膠質細胞的激活，從而起到腦保護作用。

NF-κB是細胞內重要的核轉錄因子，廣泛分布于神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞中。NF-κB的激活可以誘導多種促炎癥因子的表達，促進炎癥反應。靜息狀態下，NF-κB與其抑制因子IκB結合成復合物存在于細胞質中。在應激條件下，NF-κB被激活，進入細胞核，從而促進相關基因的表達。許多研究證實，腦缺血會導致NF-κB的活化，誘導多種促炎癥因子的表達，如IL-1β和TNF-α〔19，20〕。在本實驗中，腦缺血再灌注時細胞核內NF-κB的含量顯著地增加，NF-κB被活化。這一結果與腦缺血再灌注所致IL-1β和TNF-α的上調具有同向變化趨勢。而瑞芬太尼能顯著得抑制NF-κB的活化。這些研究結果表明，瑞芬太尼可能通過抑制NF-κB的活化，下調促炎癥因IL-1β和TNF-α的表達，從而抑制炎癥反應。

綜上，瑞芬太尼對腦缺血再灌注損傷所致的炎癥反應具有抑制作用，可能通過降低促炎癥因子的表達，增加抗炎癥因子的表達，抑制NF-κB的活化，進而起到腦保護作用。為瑞芬太尼應用于腦缺血性卒中的治療及圍術期發生腦缺血缺氧的高危患者的安全用藥提供實驗依據。

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