ET-1基因多態性與海南黎族人原發性高血壓的相關性

王 鎮 張 勇 吳 懇 金水晶 蘇 婭 周代峰 邱逸敏 黃 玲 晏輝芳

(海南省干部療養院，海南 海口 571100)

原發性高血壓(EH)是遺傳與環境因素交互作用的結果。內皮素-1(ET-1)是由血管內皮細胞分泌的血管收縮肽，也是迄今所致人體內最強烈的血管收縮劑，參與許多疾病的發生發展過程。近些年來研究發現該基因與EH的發生密切相關。基因多態性是形成個體差異的遺傳基礎，也是很多疾病發生的遺傳基礎。獲得ET-1基因多態性與EH的關聯性，對EH的防治具有重要意義。國內外有許多學者對ET-1基因多態性與高血壓相關性進行研究，但是研究結果因不同種族不同地區人群及不同研究方法有差異。本研究擬探討ET-1基因的三個多態性位點ET-1+138A/-、 K198N、G8002A與海南黎族EH的相關性。

1 對象和方法

1.1對象 EH組：隨機選取2010～2013年于海南省老年病醫院住院的海南籍黎族無血緣關系的EH病人98例，診斷符合1999年世界衛生組織(WHO)與國際高血壓學會(ISH)和2004年中國高血壓防治指南標準，即收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg。所有入選者排除繼發性高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤及嚴重肝腎功能損害。正常血壓對照組：隨機選取海南籍黎族健康居民244例，無血緣關系和高血壓家族史，排除冠心病，糖尿病，腫瘤，肝腎功損害者。

1.2方法

1.2.1引物的設計與合成 從GenBank中獲得人類ET-1基因的DNA全序列和mRNA序列, 用PRIMER6.0 軟件輔助設計引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1)。

1.2.2基因多態性檢測 ①PCR 擴增：每個多態位點均設立2個PCR檢測管,分別加入寡核苷酸正常和突變引物用于檢測每個多態位點正常和突變的等位基因。反應總體積為20 μl，反應體系如下：每管在1×PCR緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2)中含模板DNA 0.2 μg,引物各0.1～0.15 μmol/L，4種dNTP各200 μmol/L, Taq DNA聚合酶(康為世紀)1 U。加入1滴石蠟油覆蓋。PCR循環條件為94℃30 s，56℃30 s，72℃50 s，最后在72℃延伸10 min。②序列測定：隨機抽取經上述建立的等位基因特異性PCR技術檢測后分型出的各種ET-1基因型的DNA樣本，用測序引物對擴增包含有各突變位點的特異DNA片段，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行DNA 序列測定。③基因分型：每種ET-1基因突變位點都利用突變型引物和野生型引物同時進行兩管PCR擴增，根據每個樣品兩種等位基因擴增產物結果，可準確判定樣品的基因類型。

表1 等位基因特異性PCR的引物序列及擴增片段長度

1.3統計學方法 基因頻率采用基因計數法計算。研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度χ2及組間基因型與等位基因頻率比較用χ2檢驗。采用SPSS16.0軟件進行分析。

2 結 果

2.1ET-1基因三個多態位點的基因分型結果 在海南黎族人群中，K198N位點檢測出了198GG、198GT和198TT三種基因型,G8002A位點檢測出了8002GG、8002GA和8002AA三種基因型,+138A/-位點檢測出了138(4A4A)、138(4A3A)和138(3A3A)三種基因型。K198N位點在高血壓組和正常對照組間的差異達到顯著水平(P<0.05)，+138A/-在組間的差異達到極顯著水平(P<0.01)，而G8002A在組間的差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.2ET-1基因三個多態位點等位基因型檢測結果 表3可見，K198N的G和T兩個等位基因在高血壓組和對照組間的分布頻率無顯著差異，G8002A位點的G和A兩個等位基因的分布頻率具有顯著差異(P<0.05), +138A/-位點3A和4A兩個等位基因的分布頻率具有極顯著的組間差異(P<0.01)。

表3 各組中ET-1基因三種多態位點的等位基因頻率〔n(%)〕

3 討 論

EH主要是由于患者血管張力的變化所致，而后者主要受到血管內皮細胞生成的各種血管收縮因子和血管舒張因子的拮抗所影響。在上述因子中血管緊張素Ⅱ、內皮素和NO三類因子的平衡最為重要，一旦該平衡被打破，就可能導致血管張力的改變進而導致EH的發生。ET-1主要位于血管內皮細胞和平滑肌細胞，是血管收縮最重要的控制因子，該因子與血壓的升高呈正相關，因而被認為可將其濃度作為判斷EH病情的指標〔3～5〕。EH-1的濃度及活性主要取決于基因的形式，而SNP作為最常見的基因突變形式，可能與高血壓的發生密切相關。研究ET-1基因SNP位點多態性與原發性高血壓的關聯，可能為原發性高血壓的診斷、預測及干預提供參考依據。ET-1的編碼基因EDN1位于6p23-p24，目前已經發現該基因存在多態多態位點，例如轉錄起始部位1370TG，外顯子1的+138A-，內含子1的+1932G/A，第198個密碼子K198N，第4外顯子的8000T/G等。本研究選取+138A/-、 K198N、G8002A 3個多態性位點作為研究對象。EH組中+138A/-位點4A3A基因型分別頻率明顯高于正常對照組，提示基因型4A3A可能是血壓升高的一個危險因素。等位基因3A、4A在EH組分布頻率顯著高于正常對照組，說明海南籍黎族EH患者中4A型等位基因可能是血壓升高的危險因素。

K198N(Lys198Asn)是ET-1基因第158號密碼子中的G突變為T而導致了賴氨酸與天冬氨酸的轉換，是目前文獻中報道較多的多態位點〔6～8〕。海南籍黎族EH組K198N位點的GT基因型分布頻率明顯高于正常對照組。說明該位點基因型可能是黎族人群血壓升高的危險因素，與報道白種人、日本人人群的基因型GT雜合型與血壓相關符合〔7〕。

G8002A是第 4 個內含子上 G-A 轉換突變位點。黎族EH組G8002A位點上的AA基因型高于正常對照組，進一步分析G8002A位點上的A等位基因分布頻率高于正常對照組正常對照組提示A等位基因可能是黎族EH的危險因素。

綜上，本研究選取的三個ET-1多態位點中，有兩個位點的基因型出現了組間差異，對EH的預測有一定的參考價值。

4 參考文獻

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