葛根素對Lewis肺癌荷瘤小鼠的作用及機制

潘亮亮 白光振 強曉菲 張政偉 趙正源

(武警后勤學院附屬醫院胸外科，天津 300162)

葛根素藥理作用廣泛，具有調節血管收縮與舒張、降血糖、提高免疫力及抗腫瘤等功能〔1～3〕。前期研究表明，葛根素能抑制人小細胞肺癌H446細胞的生長和增殖，抑制作用呈濃度依賴性〔4〕，但僅局限于體外研究。本研究探討葛根素對荷瘤小鼠血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素(IL)-2水平與基質金屬蛋白酶(MMP-2)、-9蛋白表達的影響，初步揭示其體內抗Lewis肺癌作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1試藥 葛根素，中國藥品生物制品檢定所(批號：201011)；環磷酰胺，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司(批號：1204172)；TNF-α、IL-2檢測試劑盒，南京建成生物技術有限公司；MMP-2、MMP-9多克隆抗體，美國Sigma公司；其余試劑為國產分析純。

1.2實驗動物與瘤株 SPF級昆明種小鼠50只，8周齡，體重18～22 g，由天津大學實驗動物中心提供，適應性飼養1 w后進行實驗。Lewis 肺癌購買于北京協和醫科大學細胞庫。

1.3儀器 酶標儀，美國Bio-Tek公司；蛋白印跡電泳系統，美國Bio-Rad公司；倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司；低溫超高速離心機，德國Eppendorf公司；超低溫冰箱，日本Sanyo公司。

1.4方法

1.4.1模型制備及分組 脫頸椎處死接種Lewis肺癌細胞14 d的荷瘤小鼠，冰浴無菌條件下剝離腫瘤組織，按1∶3 比例制成細胞懸液，篩網濾過，調細胞數為l×107個/ml。50只小鼠，雌雄各半，隨機分為模型組、環磷酰胺(20 mg/kg)組、葛根素低、中、高劑量(50、100、200 mg/kg)組。腫瘤勻漿液常規方法接種在小鼠右前肢腋窩下，每只接種0.2 ml，于接種后第2天給藥，隔日給藥1次，連續給藥21 d。

1.4.2抑瘤作用評價 末次給藥24 h后，眼球取血，分離血清，按照試劑盒操作指南測定各組TNF-α和IL-2含量。取右腋皮下腫瘤組織，計算抑瘤率。完整取出雙肺，苦味酸固定后，鏡下計算雙肺表面的轉移灶數。

1.4.3免疫印跡法檢測MMP-2，-9蛋白的表達 取各組Lewis肺癌原發瘤組織100 mg，剪碎、研磨，用組織蛋白提取液溶解，并經超聲破碎后，離心(4℃，12 000 r/min，15 min)，取上清。經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)轉膜、抗體標記、顯影后，以條帶大小和深淺初步判斷MMP-2、-9蛋白的表達水平，并用Biotech凝膠圖像分析系統測定各條帶灰度值，將各組產物灰度值與3-羥-3-甲基戍二酰脫氫酶(GAPDH)灰度值比值作為各組產物的相對值。

1.5統計學方法 采用SPSS 13.0軟件，樣本均數比較采用方差分析ANOVA。

2 結 果

2.1葛根素對Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤質量及肺轉移的影響 給予葛根素21 d后，各劑量組瘤質量均顯著低于模型組(P<0.05或P<0.01)；葛根素低、中、高劑量給藥組抑瘤率分別為7.48%、19.0%和35.7%；葛根素各劑量組肺轉移灶小而少，同模型組相比，差異具有顯著性(P<0.01)。見表1。

表1 葛根素對Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤質量及肺轉移的影響±s)

2.2葛根素對Lewis肺癌荷瘤小鼠脾臟指數和胸腺指數的影響 葛根素低、中、高劑量組荷瘤小鼠脾臟指數、胸腺指數與模型組比較均具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 葛根素對Lewis肺癌荷瘤小鼠脾臟指數和胸腺指數的影響±s)

2.3葛根素對Lewis肺癌荷瘤小鼠血清TNF-α與IL-2含量的影響 葛根素各劑量組荷瘤小鼠血清TNF-α與IL-2含量呈劑量依賴性升高，葛根素中、高劑量組荷瘤小鼠血清TNF-α含量與模型組比較具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，低劑量組無統計學意義(P>0.05)。葛根素低、中、高劑量組小鼠血清IL-2含量與模型組比較均具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 葛根素對Lewis肺癌荷瘤小鼠血清IL-2和TNF-α含量的影響±s,pg/ml)

2.4葛根素對Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤組織MMP-2，9蛋白表達的影響 與模型組比較，隨著葛根素給藥劑量的增加，Lewis肺癌腫瘤組織MMP-2，9的表達量逐漸減少，與模型組比較具有統計學差異(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 葛根素對Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤組織MMP-2與MMP-9蛋白表達的影響±s)

4 討 論

癌癥是全球范圍內僅次于心腦血管疾病，死亡率高居第二位的疾病，而目前的治療手段無論是手術治療，還是放療、化療，其效果都不能讓人滿意〔5〕。在腫瘤的化學治療中，最主要的問題是其較大的毒副作用。因此，從傳統中藥中尋找療效好、毒副作用少的理想抗癌藥物越來越受到人們的重視。本研究結果表明，葛根素對Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤的增長和轉移具有顯著的抑制作用。腫瘤的發生、增長及轉移與免疫功能密切相關〔6,7〕，本研究的結果也初步證實，葛根素抗腫瘤作用與其增強免疫功能有關。MMP是一類被多種細胞分泌的一種肽鏈內切酶家族，在腫瘤的侵襲、轉移中起到了至關重要的作用。目前為止，已經有超過17種的人類 MMP 被測序〔8〕，其中研究最多、最深入的為MMP-2 和 MMP-9。大量的實驗及臨床研究均證實，MMP-2 和 MMP-9在乳腺癌、直腸癌、結腸癌和肺癌等多種腫瘤的侵襲、轉移中扮演著重要的角色〔9～11〕。因此，MMP抑制劑將可以顯著降低腫瘤細胞的侵襲、轉移能力。葛根素能夠劑量依賴性的抑制MMP-2與MMP-9蛋白表達，此種抑制作用可能是葛根素抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤增長和轉移的機制之一。

4 參考文獻

1趙瑩蓮.葛根素的藥理作用及臨床應用進展〔J〕.安徽醫藥, 2010；14(12): 1377-9.

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