雷帕霉素對早期糖尿病大鼠腎臟TGF-β1、FN表達的影響

李琳琳 鄭祥雄

(福建醫科大學附屬協和醫院免疫研究所，福建 福州 350001)

早期糖尿病腎病(DN)主要表現為腎小球及腎小管的肥大、基底膜的增厚、細胞外基質(ECM)的異常聚集。已有研究表明，轉化生長因子(TGF)-β1是一個對腎臟肥大及ECM聚積均發揮重要作用的細胞因子。纖維連接蛋白(FN)是ECM的主要成分之一。雷帕霉素是一種免疫抑制劑。近年研究提示，雷帕霉素能抑制單腎切除所誘導的殘余腎臟肥大〔1〕，還能抑制系膜細胞增殖及Ⅳ型膠原的合成〔2〕。由于單側腎切除所致代償性腎肥大與糖尿病狀態下腎肥大具有一定相似性，并且系膜細胞的增殖及ECM的聚集都是DN發展的關鍵因素。因此，本研究擬通過鏈脲佐菌素(STZ)誘導DN大鼠模型，用雷帕霉素進行干預治療，通過觀察糖尿病大鼠腎臟病理變化及TGF-β1 、FN表達的變化，來初步探討雷帕霉素對糖尿病腎臟保護功能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 24只雄性清潔級SD大鼠，體重180～250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1.2DN病模型的建立及分組 大鼠隨機分為對照組8只(C組)與DM組16只，糖尿病組禁食12 h后一次性腹腔注射1%STZ(瑞士ALEXIS公司) 75 mg/kg體重。注射后72 h及1、2、4 w末內眥靜脈取血測血糖。血糖>16.7 mmol/L、尿糖強陽性者作為糖尿病模型建立成功的標準，不達標者退出實驗。將16只DM大鼠再分為DM雷帕霉素干預組8只(DN+RAP組)與非干預組8只(DN組)。DN+RAP組從第5周起予雷帕霉素1 mg·kg-1·d-1灌胃治療，C組與DN組每天經口灌胃等量溶媒0.5%羧甲基纖維素直至第12周末實驗結束。

1.3主要試劑 STZ(瑞士 ALEXIS公司)，用前溶于0.1 mol/L的無菌枸櫞酸緩沖液中，pH4.4。兔抗大鼠TGF-β1 系美國SANTA CRUZ公司產品，兔抗大鼠FN 系LAB VISION公司產品，山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體(二步法免疫組化試劑)、DAB均系北京中杉金橋生物技術公司產品。Trizol,美國Invitrogen公司。逆轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、10×倍緩沖液、dNTP均系Fermentas公司產品。TGF-β1、β-actin 引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。

1.4觀察指標和測定方法

1.4.1生化指標檢測 血、尿肌酐采用自動生化分析儀進行檢測，Ualb采用貝克曼特定蛋白分析儀檢測(免疫比濁法)，計算出體重校正的內生肌酐清除率(Ccr)。

1.4.2腎組織病理檢查 蠟塊切3 μm薄片，分別行HE、PAS、PASM 染色。光鏡下觀察HE、PAS、PASM染色切片的腎組織形態學改變。在400倍放大倍數下，每張HE切片按順時間方向隨機選取20個正切的腎小球，應用圖像軟件分析系統(Image-Pro-Plus6.0)計算每個正切腎血管球的直徑(RG)、面積(AG)、體積(VG)。同樣方法下分析PASM切片，計算每個腎小球PASM染色陽性面積與腎小球面積比，最后求20個小球此比值的均數，即為每張切片的系膜基質擴張指數(MMEI)。

1.4.3免疫組化二步法觀察FN、TGF-β1蛋白在腎組織的定位和表達 切片厚度3 μm，常規脫蠟至水，封閉內源性過氧化物酶，高壓抗原修復，分別加入FN(1∶100)、TGF-β1 (1∶100)多克隆抗體(一抗)37℃孵育，以PBS代替一抗作陰性對照；分別加入相應的二抗，DAB顯色。在高倍鏡下(×400)每張切片選取30個腎小球分別攝片，應用圖像軟件分析系統(Image-Pro-Plus6.0)分別計算每個腎小球上FN、TGF-β1表達的整合光密度及相應的腎小球面積，兩者比值即為每個腎小球FN、TGF-β1 表達的腎小球指數，計算30個腎小球此比值均數，即為每張切片FN 、TGF-β1陽性表達的腎小球指數。

1.4.4RT-PCR檢測FN、TGF-β1mRNA表達 采用Trizol 試劑提取腎皮質總RNA。調整各標本RNA濃度一致。將RNA反轉錄為cDNA,在Taq多聚酶催化下,進行PCR擴增。TGFβ1引物序列上游:GCACCATCCATGACATGAAC，下游:CCTTGCTGTACTGTGTGTCCA，產物：272 bp。 FN引物序列上游：CCGGGTTCTGAGTACACAGTC，下游：AGGGACCACTTCTCTGGGAGG，產物：768 bp 。β-actin引物序列上游：CATCCTGCGTCTGGACCT，下游:TCAGGAGGAGCAATGATCTTG，產物：475 bp。TGF-β1反應條件為： 95 ℃預變性5 min,94 ℃變性40 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,72℃終末延伸10 min,共35循環。 FN反應條件：95 ℃預變性5 min,94 ℃變性40 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,72 ℃終末延伸10 min,共35循環。

1.5統計學方法 采用SPSS11.0軟件行單因素方差分析，LSD檢驗和Games-Howell檢驗。

2 結 果

2.1一般生化指標 DN+RAP組及DN組較C組體重減輕，血糖、尿量明顯增加(P<0.01),24 h Ualb、體重校正的Ccr也明顯升高，表明DN建模成功。DN+RAP組24 h Ualb、Ccr較DN組降低(P<0.05)。DN+RAP組與DN組大鼠血糖比較無差異。見表1。

表1 各組大鼠生化指標變化±s,n=8)

2.2腎組織病理檢查結果 與C組相比，DN組腎重/體重顯著增大，DN+RAP組腎重/體重較DM組減小，但還未降至C組水平。PAS切片上，DN組腎小球明顯增大，伴球囊腔擴大,表現為正切面積、腎小球體積較C組明顯增大(P<0.01),DN+RAP組腎小球正切面積、腎小球體積較DN組降低(P<0.01)。見表2。DN組大鼠小血管玻璃樣變，腎小球系膜基質增多，基底膜增厚，EMMI較C組增大，DN+RAP組EMMI較DN組降低(P<0.01)。見圖1。

表2 各組大鼠腎小球平均面積、體積、EMMI的變化±s，n=8)

圖1 三組大鼠腎組織病理變化(PAS染色，×400)

2.3TGF-β1、FN在腎組織的定位和表達 C組TGF-β1主要表達于腎小管上皮細胞，呈淺黃色，少量表達于腎小球。12 w末DN組大鼠TGF-β1表達較C組顯著增強(P<0.05)，在腎小球呈索條狀分布，呈棕黑色，染色深，腎小管及腎間質表達也明顯增強。DN+RAP組TGF-β1表達較DN組下調(P<0.05)。見表3，圖2。FN主要定位于腎小球系膜基質及基底膜，腎小管間質亦有少量表達。C組腎小球內可見散在的棕黃色陽性染色，著色淺。DN組較C組FN蛋白表達明顯上調(P<0.01)，在腎小球內呈密集條索狀著色。DN+RAP組腎小球內陽性染色較DN組減輕(P<0.01)。見表3，圖3。

2.4腎組織中TGF-β1、FN mRNA的表達 DN組TGF-β1 mRNA較C組明顯升高(P<0.01)，DN+RAP組TGF-β1 mRNA表達量較DN組顯著下降(P<0.01)，但其表達仍然高于C組(P<0.05)。C組大鼠腎組織FN低表達， DN組FN較C組表達明顯升高(P<0.01)，DN+RAP組FN mRNA的表達量顯著低于DN組(P<0.01)。見表3，圖4。

圖2 各組大鼠腎組織中FN蛋白表達的變化(DAB,×400)

圖3 各組大鼠腎組織中TGFβ1蛋白表達的變化(DAB,×400)

M：Marker，1～3：C組，DN+RAP組，DN組

圖4各組大鼠腎臟TGF-β1、FNmRNA表達

表3 各組大鼠腎小球TGF-β1、FN腎小球陽性指數及腎皮質灰度的表達±s，n=8)

3 討 論

腎小球肥大及基底膜增厚是早期DN病的主要表現，本糖尿病早期腎臟肥大常有短暫的細胞增殖，隨后是較長時間的腎臟細胞的體積增大和代謝亢進〔3〕。磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)又稱為蛋白激酶B(PKB)位于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的上游。PI3-K/AKT/mTOR通路的調控失常在糖尿病狀態下腎臟肥大中發揮了一定的作用。營養及生長因子信號激活PI3-K，進而導致AKT活化，AKT活化直接激活mTOR，mTOR通過磷酸化其下游的兩個效應因子P70S6K及4EBP-1，從而啟動翻譯過程，促進RNA和蛋白質的合成〔4〕。大量蛋白質物質在細胞內的堆積，造成蛋白質/DNA比例失調，導致細胞肥大。Nagai等〔5〕研究高糖環境下系膜細胞肥大的機制，發現系膜細胞中AKT及mTOR是被激活的。雷帕霉素進入細胞后，與其胞質受體FK-506結合蛋白-12相結合形成藥物-受體復合物，能與mTOR相互作用，抑制P70S6K的活化和4EBP-1的磷酸化，從而抑制RNA和蛋白質的合成。本研究提示抑制糖尿病大鼠腎小球細胞肥大、改善腎功能，可能是其延緩DN病進展的機制之一。

TGF-β1可通過促進細胞蛋白質合成，阻止細胞從G1期過渡到S期，從而抑制細胞增殖促進其肥大〔6〕。TGF-β1還能通過促進細胞外基質蛋白如膠原、FN和laminin的合成來增加ECM聚集。ECM的各種成分中以FN的反應最為迅速和持久，先于膠原Ⅳ、膠原Ⅴ和層黏蛋白，其持續增加促進腎臟纖維化進展。Goc等〔7〕的研究顯示，TGF-β能通過活化AKT /mTOR及其下游的P70S6K和4EBP-1通路，進而刺激細胞外基質蛋白包括FN的合成，而mTOR抑制劑雷帕霉素可在翻譯水平阻斷TGF-β對FN等系膜基質的刺激合成。本研究結果提示，雷帕霉素能夠通過下調TGF-β1表達，進而抑制FN等系膜基質聚集，從而達到延緩DN病進展的目的。

4 參考文獻

1Chen JK,Chen J,Neilson EG,etal.Role of mammalian target of rapamycin signaling in compensatory renal growth〔J〕.J Am Soc Nephrol,2005;16(5): 1384-91.

2Lock HR ,Sacks SH ,Robson MG. Rapamycin at sub immunosuppressive levels inhibits mesangial cell proliferation and extracellular matrix production〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2007;292(1):76-81.

3Young BA,Johnson RJ,Alpers CE,etal.Cellular events in the evolution of experimental diabetic nephropathy〔J〕.Kidney Int,1995;47(3): 935-44.

4Hay N,Sonenberg N. Upstream and downstream of mTOR〔J〕.Genes Dev,2004;18(16): 1926-45.

5Nagai K,Matsubara T,Mima A,etal. Gas6 induces AKT/mTOR-mediated mesangial hypertrophy in diabetic nephropathy〔J〕.Kidney Int,2005;68(2):552-61.

6Schoecklmann HO,Rupprecht HD,Zauner I,etal. TGF-β1 induced cell cycle arrest in renal mesangial cells involves inhibition of cyclinE-cdk2 activation and retinoblastoma protein phosphorylation〔J〕.Kidney Int,1997;51(4):1228-36.

7Goc A,Choudhary M,Byzova T,etal.TGF-β and Bleomycin-induced extracellular matrix synthesis is mediated through AKT and mammalian target of rapamycin〔J〕.J Cell Physiol,2011;226(11):3004-13.