結直腸癌中三聯脆性組氨酸、Bcl-2基因的表達及意義

付信娟 孫方利 孫文琴 王和香

(青島市海慈醫療集團消化內科，山東 青島 266033)

三聯脆性組氨酸(FHIT)基因〔1〕是近年發現的抑癌基因之一，已發現其在多種腫瘤組織中出現異常表達，但FHIT基因在結直腸癌中的表達情況及意義并無一致意見。Bcl-2是細胞凋亡中重要的調控因子，通過抑制細胞凋亡而促進腫瘤發生發展。本試驗擬探討FHIT、Bcl-2基因在結直腸癌中的表達情況及與結直腸癌發生、發展和轉移的關系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 89例結直腸癌標本均來自青島市海慈醫療集團2002年1月至2008年12月外科手術后經病理確診的存檔蠟塊。其中男52例，女37例，年齡43～85歲，平均年齡64.2歲。按改良Duke分期，A期16例，B期26例，C期24例，D期23例。按組織學分級，高分化組17例，中分化組52例，低分化組20例。有淋巴結轉移47例，無淋巴結轉移42例。所有病例術前均未做放療、化療和免疫治療。正常對照組織標本20例來源于距癌腫5 cm以上正常結直腸黏膜組織，病理證實無腫瘤細胞浸潤，無明顯炎癥反應及細胞增生等異常病變。

1.2材料與方法 免疫組化染色采用SP法。兔抗人多克隆抗體FHIT(即用型)、Bcl-2兔抗人多克隆抗體、SP 免疫組化試劑盒及顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術公司。標本經 10%的甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片，常規 HE染色。所有標本在同一條件下嚴格按試劑盒說明書操作，DAB顯色。選用公司提供的已知FHIT陽性染色結直腸癌切片在同一條件下染色作為陽性對照，以PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.3結果判定標準 FHIT、Bcl-2蛋白均定位于胞質，呈棕黃色或棕褐色表達。每例標本隨機選取10個高倍視野，計數300個細胞，根據著色強度及陽性細胞結果進行定性分析：先按染色強度記分：0分、1分、2分、3分分別表示無色、淺黃色、棕黃色、棕褐色。再按陽性細胞所占百分比記分：0分為陽性細胞<5%，1分為陽性細胞5%～25%，2分為陽性細胞25%～50%，3分為陽性細胞50%～75%，4分為陽性細胞>75%。染色強度與陽性細胞所占的百分比的乘積0～4為陰性，6～12為陽性。

1.4統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗和Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1FHIT、Bcl-2蛋白在結直腸癌組織和癌旁正常結直腸黏膜組織中的表達 見圖1。FHIT蛋白在結直腸癌組織中的陽性率明顯低于正常結直腸黏膜組織(58.4% vs，95.0%，P=0.002)。Bcl-2蛋白在結直腸癌組織中的陽性率明顯高于正常結直腸黏膜組織(71.9% vs 40.0%，P=0.006)。

圖1 FHIT、Bcl-2基因在不同結直腸黏膜組織的表達(SP)

2.2結直腸癌組織中FHIT、Bcl-2蛋白表達與臨床病理特征的關系 結直腸癌組織中FHIT蛋白表達在A期、B期、C期、D期中的陽性率逐漸降低(P<0.05)。隨腫瘤細胞分化程度的降低，FHIT蛋白表達降低(P<0.05)。在淋巴結轉移組，FHIT蛋白陽性率明顯低于無淋巴結轉移組(P<0.05)。FHIT蛋白在結直腸癌組織中表達與患者性別、年齡無關。結直腸癌組織中隨腫瘤細胞分化程度的降低，Bcl-2表達升高(P<0.05)。Bcl-2蛋白在淋巴結轉移組的陽性率明顯高于無淋巴結轉移組(P<0.05)。Bcl-2蛋白表達情況與腫瘤Duke分期、患者性別、年齡無關。見表1。

表1 結直腸癌組織中FHIT、Bcl-2陽性表達與臨床病理特征的關系〔n(%)〕

2.3結直腸癌組織中FHIT、Bcl-2 表達的相關性 結直腸癌組織中FHIT與Bcl-2的表達有一定相關性(r=0.257,P=0.010)。

3 討 論

FHIT基因是 Ohta等〔1〕在1996年用定位克隆技術和外顯子捕獲法在3p14.2上確定的一個新基因，也是第1個將脆性位點和腫瘤聯系起來的抑癌基因。FHIT基因定位于染色體3p14.2，全長約500 kb，由10個外顯子組成，其cDNA全長1 095 bp，轉錄產物約為1.1kb的mRNA，編碼產物是由147個氨基酸組成的分子量為16.8 kD的蛋白質，定位于細胞質。研究證實〔2〕FHIT體外編碼二腺苷三磷酸(Ap3A)水解酶，在全身正常組織器官均有低水平表達，且FHIT基因在多種腫瘤組織中均出現表達降低甚至缺失，但對于FHIT基因影響腫瘤發生發展的具體機制尚不明確。

本研究結果提示FHIT基因與結直腸癌的發生有關。王佩飛等〔3〕研究發現：FHIT在正常結腸黏膜、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變及結腸癌腫的表達逐漸降低，均表明FHIT表達降低與結直腸癌的發生發展有關。FHIT蛋白的表達與腫瘤組織分化程度、Duke分期、淋巴結轉移有關，與性別、年齡無關，而這也說明FHIT蛋白的表達與結直腸癌的進一步發展及腫瘤浸潤有關。Sarli 等〔4〕研究發現，FHIT蛋白表達降低與錯配修復基因缺乏有關，提示FHIT基因可能通過涉及微衛星不穩定性(MSI)的基因通路影響結直腸癌的發生。楊平等〔5〕研究發現，FHIT基因可能參與結直腸癌細胞凋亡的調節，其表達下降可能與結直腸癌發生相關。

Bcl-2基因位于18q21，由3個外顯子組成，編碼239個氨基酸組成的分子量為26 kD的Bcl-2A蛋白和205個氨基酸組成的分子量為22 kD的Bcl-2B蛋白。Bcl-2 是調節細胞凋亡的重要基因，主要通過調節線粒體的功能來抑制細胞凋亡，延長細胞生存，其過表達參與腫瘤的發生，是腫瘤靶向治療的潛在基因。楊闖等〔6〕報道，Bcl-2基因的表達與肝細胞癌的發病年齡、性別、重量大小、UICC分期和轉移均無關，而關于Bcl-2 的表達與結直腸癌發生、發展及轉移的關系，國內外報道不一。本實驗提示其可作為判斷結直腸癌惡性程度的指標之一，與鄧文英等〔7〕報道一致。Barrasa等〔8〕報道，對丁酸鹽抵抗的結腸腺癌細胞系(BCS-TC2.BR2)，通過增加Bcl-2的表達，降低了其對膽汁酸誘導的凋亡的敏感性。

本研究結果顯示FHIT蛋白表達降低及Bcl-2蛋白表達升高可以作為判斷結直腸癌惡性程度及預測其發展、轉移的指標，也為腫瘤的綜合治療提供重要的試驗支持。目前針對FHIT的基因治療已取得可喜進展，而針對Bcl-2的小分子抑制劑也為腫瘤的靶向治療提供了新的研究方向。

4 參考文獻

1Ohta M，Inoue H，Cotticelli MG，etal.The FHIT gene，spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t(3；8)breakpoint，is abnormal in digestive tract cancers〔J〕.Cell，1996；84(4)：587-97.

2Barnes LD，Garrison PN，Siprashvili Z，etal.Fhit，a putative tumor stppressor in humans，is a dinucleoside 5′，5′′′-P1，P3-triphosphate hydrolase〔J〕.Biochemistry，1996；35(36)：11529-35.

3王佩飛，陳建武，鄭佩贊，等.Survivin、fhit在結直腸良惡性病變中的表達及意義〔J〕.醫學研究雜志，2008；37(1)：37-40.

4Sarli L，Bottarelli L，Azzoni C，etal.Abnormal Fhit protein expression and high frequency of microsatellite instability in sporadic colorectal cancer〔J〕.Eur J Cancer，2004；40(10)：1581-8.

5楊 平，曹 杰，王 輝，等.FHIT mRNA在結直腸癌中的表達及其與細胞凋亡的相關性〔J〕.嶺南現代臨床外科，2007；7(1)：7-10.

6楊 闖，魏振彤，鄭 宇，等.肝癌中Bcl-2、Bax和C-myc基因的表達及其臨床意義〔J〕.中國老年學雜志，2009；29(4)：450-1.

7鄧文英，羅素霞，陳小兵，等.Bcl-2、Caspase-3在結直腸癌中的表達及意義〔J〕.現代腫瘤醫學，2009；17(12)：2363-5.

8Barrasa JI，Santiago-Gomez A，Olmo N，etal.Resistance to butyrate impairs bile acid-induced apoptosis in human colon adenocarcinoma cells via up-regulation of Bcl-2 and inactivation of Bax〔J〕.Biochem Biophys Acta，2012；1823(12)：2201-9.