厄洛替尼抑制核轉錄因子κB表達及其對胰腺癌細胞侵襲力的影響

王 林 張秀艷 石國剛 于錦萍 陳 紅 房 芳

(河北聯合大學附屬醫院分院藥劑科，河北 唐山 063000)

胰腺癌術后轉移是胰腺癌手術切除治療的難點。有報道胰腺癌組織中表皮生長因子受體(EGFR)的陽性率接近50%，并參與了胰腺癌的發生、發展和轉移。本文擬觀察厄洛替尼對胰腺癌細胞生長、侵襲的影響及核轉錄因子(NF)-κB的表達變化。

1 材料和方法

1.1材料 人胰腺癌細胞株(PANC-1)購自中國科學院上海細胞生物學研究所。噻唑藍(MTT)購于美國Sigma aldrich公司RAD001用二甲基亞砜(DMSO)配制成1 mmol/L貯備液，實驗時用RPMI1640培養液稀釋至實驗所需濃度。

實驗分為空白對照組、表皮生長因子(EGF)處理組、厄洛替尼處理組、EGF聯合厄洛替尼處理組。EGF、厄洛替尼作用濃度分別為10 ng/ml、4 μmol/L。聯合組為EGF先作用24 h后再加厄洛替尼作用4 h。

1.2方法 MTT比色法檢測細胞增殖變化。調節PANC-1細胞濃度，以3×103/孔接種于96孔培養板中，每組設6個復孔，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，輕輕吸棄培養液，每孔加入150 ml DMSO，振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光密度(OD)值，計算各組細胞抑制率，抑制率=〔(空白對照組OD值-各實驗組OD值)/空白對照組OD值〕× 100%。

Transwell體外侵襲實驗：分別收集各處理組的PANC-1細胞培養上清液，置于8 μm孔徑的Transwell板(購自Nunc公司)，于半透膜上層加入2×105PANC-1細胞系。4 h后于顯微鏡以不同高倍視野(5個高倍視野)下計數每個高倍視野平均細胞數。

Western印跡檢測NF-κB的p65蛋白水平的表達。收集各組細胞，加裂解液冰上裂解，12 000 r/min離心10 min，取上清測定濃度后-80℃保存備用。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，完畢后將蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉，后放入含一抗的Tris鹽酸緩沖液(TBST)，4℃過夜，洗膜，然后用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫反應1 h，目標蛋白質用二氨基聯苯胺(DAB)顯色。計算機掃描，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)蛋白做參照。

2 結 果

厄洛替尼對人PANC-1細胞的生長具有抑制作用，并且具有劑量依賴性(P<0.05)。EFG促進PANC-1細胞侵襲，厄洛替尼作用于PANC-1胰腺癌細胞上清液條件培養基可顯著抑制PANC-1細胞的侵襲(P<0.05)。Western印跡結果顯示，厄洛替尼作用48 h后可以顯著抑制胰腺癌PANC-1 細胞分泌NF-κB，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 厄洛替尼抑制PANC-1細胞的生長(%)

3 討 論

盡管手術是惟一有望治愈胰腺癌的方法，但胰腺癌早期很難發現，臨床上的診斷病例大多為晚期，僅10%～20%的患者具有手術根治切除的機會〔1〕。侵襲和轉移是胰腺癌患者死亡的主要原因。已有學者證實EGF及其受體在這一過程中起重要作用〔2〕。厄洛替尼為人表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，主要通過與三磷酸腺苷競爭結合至EGFR胞內酪氨酸激酶功能域，抑制受體自磷酸化而阻止下游信號傳導，從而抑制細胞周期進程，加速細胞凋亡，抑制血管生成，進而產生抗腫瘤作用〔3〕。本文結果表明，厄洛替尼可以抑制胰腺癌的侵襲和轉移。

NF-κB是一種重要的細胞內信號因子，由P50和P65組成的二聚體，調節許多與細胞生長和分化相關的基因表達〔4〕。胰腺癌組織有較高的NF-κB活性和表達，對于胰腺癌的發展起著一定的推波助瀾作用。同時，有研究證實使用NF-κB抑制劑可以阻斷NF-κB P65的表達及NF-κB的DNA結合活性〔5〕。本研究發現應用厄洛替尼處理后的胰腺癌PANC-1 細胞增殖明顯受到抑制，并且能夠明顯下調NF-κB的活性。因此，厄洛替尼通過抑制EFG介導的NF-κB的活化，發揮其抑制胰腺癌細胞增殖和侵襲作用。

4 參考文獻

1Tang ZY，Wu YL，Gao SL，etal.Effects of the proteasome inhibitor bortezomib on gene expression profiles of pancreatic cancer cells〔J〕.J Surg Res，2008；145(1)：111-23.

2張 浩，劉小芳，劉昱翼，等.EFG介導的NF-κB促進體外胰腺癌細胞的uPA表達與侵襲力〔J〕.中華腫瘤雜志,2007；29(12)：909-12.

3Vaira V,Lee CW,Goel HL,etal. Regulation of survivin expression by IGF-1 /mTOR signaling〔J〕.Oncogene，2007;26(19)2678-84.

4Egan LJ,Toruner M.NF-κB signaling pros and cons of the ring NF-κB as a therapeutic approach.〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2006;1072(1)：114-22.

5程卓鑫,孫 備,王雙佳,等.核因子κB在缺氧微環境中對胰腺癌細胞上皮-間質轉化調控作用的實驗研究〔J〕.中華外科雜志,2012;50(5):446-51.