鼻咽癌中環氧化酶-2的實驗研究

陳廣理 王俊周 郭曉民 楊明

環氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)是前列腺素(PGs)合成過程中主要限速酶, 不僅在炎癥等過程中發揮重要作用, 而且還與腫瘤的增生、浸潤和轉移密切相關［1］。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是具有極高的浸潤和轉移能力的腫瘤本實驗通過RT-PCR方法研究在鼻咽癌中COX-2的表達, 探討COX-2在鼻咽癌的增生、浸潤及轉移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 鼻咽癌及相應癌旁組織26例, 來源于本院鼻咽部活檢標本, 其中有淋巴結轉移病例19例、無淋巴結轉移病例7例。癌旁組織取自腫瘤邊緣5 mm以外區域, 10例正常鼻咽部黏膜組織取于鼻咽部正常的手術患者。病理學診斷均為鱗狀細胞癌, 其中高分化3例、中分化4例、低分化19例。其中男19例, 女7例, 年齡最小27歲, 最大78歲,平均年齡(48.026±5.517)歲, 術前均未經化療或放療。

1.2 主要試劑與儀器 逆轉錄酶MLV(MBI), TRIzol試劑(GibCO),dNTP(MBI), TaqDNA聚合酶(MBI), GDS8000型凝膠成像系統(UVP), PTC-200 PCR儀(MJA), Grab-it 4.0分析軟件為Gelworks 1D interdiate, DU650型紫外光分光光度儀(BECKMAN)。

表1 PCR 引物序列和 PCR產物片斷長度

1.3 引物設計 泳道M：Marker；泳道1～2分別是COX-2 mRNA在無淋巴結轉移的鼻咽癌組織和有淋巴結轉移鼻咽癌組織中的PCR產物(236 bp)；泳道3～4分別是COX-2 mRNA在癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中的PCR產物(236 bp)。見表1。

1.4 組織RNA提取和cDNA合成 取約50 mg組織放入勻漿器中, 勻漿加入1 ml TRIzol, 用氯仿和異丙醇逐步提取RNA, 溶于焦碳酸二乙脂水中, 然后應用紫外分光光度儀檢測定量。

1.5 RT-PCR反應 以cDNA為模板, 擴增COX-2 (236 bp)及β-actin (300 bp)等基因片斷。

PCR 反應體系為 25 μl, 含上述基因 cDNA 2.0 μl, dNTP 的終濃度0.2 mmol/L, 10×Buffer 2.5 μl, Mg2+的終濃度2.0 mmol/L,TaqDNA聚合酶1 U, 上游和下游引物的終濃度各0.2 μmol/L。β-actin為內參照物。

PCR反應條件為95℃預變性5 min, 95℃ 1 min、50℃1 min、72℃ 1 min, 然后72℃延伸5 min。反應結束后取5 μl產物電泳, 用grab-It成像系統照像, 然后分析各條帶的積分吸光密度值, 以目的基因與β-actin的相對積分吸光密度值記錄結果。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 采用t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 在鼻咽癌組織中COX-2 mRNA高表達, 在正常鼻咽部黏膜中低表達 本實驗研究表明COX-2 mRNA在全部鼻咽癌組織中高表達, 見圖1, COX-2 mRNA在無淋巴結轉移的鼻咽癌組織、有淋巴結轉移鼻咽癌組織中平均相對吸光度值分別為：(0.7632±0.0411)和(0.7951±0.0364), 二者之間差異無統計學意義(t=1.371, P>0.05)。

2.2 在鼻咽癌癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中COX-2 mRNA低表達, 見圖1, 相對平均吸光度值分別為：(0.2069±0.0372)、(0.2183±0.0417)。二值差異無統計學意義(t=1.358, P>0.05)。

圖1 在鼻咽癌組織、癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中COX-2 mRNA的表達

2.3 在鼻咽癌組織中COX-2 mRNA的表達與在正常鼻咽部黏膜COX-2 mRNA的表達之間, 差異均具有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

鼻咽癌為我國最常見的惡性腫瘤之一, 是極易轉移的腫瘤, 通常頸淋巴結轉移常為患者最早發現的體征, 頸部腫塊為此病首發者約占60%。COX-2在正常組織中不表達或微量表達, 而在病理情況下, COX-2在炎癥、腫瘤等組織中表達增高, COX-2的高表達與多種腫瘤的發生發展關系密切［1］。本實驗檢測表明, COX-2在鼻咽癌組織中均高表達, 在癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中低表達。本實驗結果表明, 鼻咽癌的增長、浸潤及轉移與COX-2的高表達有密切的關系。

3.1 COX-2促進腫瘤新生血管的形成血管內皮生長因子(VEGF)是促進腫瘤新生血管生成的作用最強的因子之一。在腫瘤中高表達的COX-2可促使VEGF生成增加, COX-2與VEGF協同作用, 促進腫瘤新生血管的生成［2］。文獻報道,在鼻咽癌中VEGF高表達, 鼻咽癌的失控增殖能力與VEGF的高表達有密切關系。結合本實驗結果, 在鼻咽癌組織中COX-2高表達, 表明COX-2與VEGF共同促進鼻咽癌新生血管的生成。

3.2 COX-2促進腫瘤細胞的增殖 在腫瘤中COX-2高表達, 促進腫瘤合成大量PGs, 進而促進腫瘤細胞增殖［3］。結合本實驗結果, COX-2在鼻咽癌組織中均高表達, 表明COX-2促進了鼻咽癌細胞的增殖。

3.3 COX-2促進腫瘤的浸潤和轉移 研究表明, 在腫瘤組織中COX-2表達增高, 同時有基質金屬蛋白酶-2和基質金屬蛋白酶-9的表達升高, E-鈣粘連素的表達降低, 共同促進了腫瘤細胞的浸潤和轉移。鼻咽癌是具有極高浸潤和轉移能力的腫瘤, 本實驗結果顯示, COX-2在鼻咽癌組織中均高表達, 表明COX-2促進了鼻咽癌細胞的浸潤和轉移。

綜上所述, 鼻咽癌中COX-2表達升高, 說明了鼻咽癌細胞的增生、浸潤及轉移與COX-2的高表達有密切關系。因此,COX-2成為了研究和治療腫瘤的重要靶分子之一, 在抗腫瘤的研究治療中有重要的意義。

［1］Fukazawa EM, Baiocchi G, Soares FA, et al.Cox-2, EGFR, and ERBB-2 Expression in Cervical Intraepithelial Neoplasia and Cervical Cancer Using an Automated Imaging System.Int J Gynecol Pathol, 2014, 33(3):225-234.

［2］Nagoya H, Futagami S, Shimpuku M, et al.Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1 is associated with angiogenesis and VEGF production via upregulation of COX-2 expression in esophageal cancer tissues.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2014,306(3):183-190.

［3］Zhao H, Luo F, Li H, et al.Antinociceptive Effect of Tetrandrine on LPS-Induced Hyperalgesia via the Inhibition of IKKβ Phosphorylation and the COX-2/PGE2 Pathway in Mice.PLoS One,2014, 9(4):e94586.