褪黑素對年齡相關的小鼠腦組織細胞外調節蛋白激酶和蛋白質二硫鍵異構酶活性的影響

楊鳳真 王 芳 周 麗 黃利華 周 軍 李聞文

(中南大學湘雅醫學院，湖南 長沙 410013)

近年來對褪黑素(MLT)和衰老的相關性研究受到關注，隨著年齡的增長MLT水平及其分泌節律性降低，使衰老的機體易于發生疾病〔1，2〕。而外源性應用MLT可以延長壽命，推遲衰老〔3〕。本實驗研究MLT對不同年齡小鼠腦組織細胞外調節蛋白激酶(ERK)和蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)表達的影響，探討MLT與年齡相關的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物分組與模型制備 雄性B6C3F1小鼠，為C57BL/6和C3H的雜交品種，5.5月齡(年輕組)20只，10只為年輕對照組(YC)， 10只為年輕MLT處理組(YM)；26月齡(老年組)20只，10只為老年對照組(OC)，10只為老年MLT處理組(OM)，4組小鼠均2個或4個一籠飼養在溫控室(22±1)℃，并給予12 h的日光與暗室循環交替。動物隨意攝取食物和水，YC和OC組小鼠均給予基礎飼料，由10%蔗糖、14%干酪素和少量的鹽、維生素混合而成。而YM和OM組則給予含有0.04 mg/kg MLT的基礎飼料喂養，所有動物連續喂養2.5個月。

1.2腦組織切片標本制備 2.5個月后取各組小鼠腦組織，先以0.1%戊巴比妥鈉(150 mg/kg)深度麻醉小鼠，暴露心臟，經左心室灌注生理鹽水，待小鼠肝臟顏色變淺后，取出腦組織，取出的腦組織分為兩半，一半置于-80℃冰箱備用， 另一半固定于新鮮配制的4%多聚甲醛溶液中4℃冰箱過夜，次日以0.01 mol/L的磷酸緩沖液(PBS)反復浸洗，最后將腦組織梯度酒精脫水、透明、石蠟包埋、冠狀切片(厚約5 μm)備用。

1.3免疫組織化學方法 脫蠟后的切片入PBS，經抗原修復液(美國Vector, H-3300)在80%水浴箱內修復20 min, 切片自然冷卻后PBS浸洗2次, 每次5 min，再入3%H2O2室溫反應5 min，以消除內源性過氧化物酶的活性，經PBS洗滌后，切片孵育在2%小牛血清中1 h以減少非特異性反應。實驗中所用一抗ERK購自美國Santa Cruz公司，PDI購自Assay Designs公司。切片在ERK(1∶100)和PDI(1∶500)抗體中4℃冰箱孵育過夜，所用一抗均由1.5%羊血清、0.15%Triton X100和0.01 mol/L PBS配制，次日一抗經PBS洗滌3次后, 加入相應二抗(1∶400)，室溫孵育2 h，PBS洗滌，然后在以生物素與卵白素結合(ABC)配制的混合液中孵育2 h。底物呈色反應采用DAB試劑盒，顯微鏡下觀察陽性反應程度，DAB顯色時間約為3～5 min。 免疫組化過程中所使用的二抗、ABC和DAB試劑盒均購自美國Vector公司。呈色反應后，切片經酒精逐級脫水和二甲苯透明后采用加拿大中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果。

1.4數據采集 上述免疫組織化學反應的切片在日本Nikon Eclipse 80i熒光顯微鏡下觀察結果，用Nikon DS高分辨率數碼相機經NIS-Elements AR 3.0軟件(1 280×1 024 pixel)對腦組織切片拍照收集腦皮質與海馬等部位切面圖像。數字化的圖像則由Ver.3.00程序軟件作半定量分析(陽性染色區域百分比取每張切片的5個不連續高倍鏡視野的平均值)，所有實驗均重復至少2次，每組統計動物數在8個以上。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1ERK的免疫組化檢測結果 ERK在各組小鼠腦組織均有不同程度表達，分布較為廣泛，陽性產物見于神經元的胞質、胞核和突起。年輕組小鼠(YC、YM)腦組織的ERK反應均較強，陽性細胞數量較老年組多(P<0.05)，細胞染色較深，YC和YM組ERK陽性反應差異有統計學意義(P<0.05)，YM組陽性細胞數多于YC組。ERK在老年組腦組織海馬和皮質部位均有表達，但老年組ERK反應明顯減弱，陽性細胞數量減少，OC組僅見少量陽性反應，OM組ERK陽性反應較OC組強(P<0.05)。見圖1。

2.2PDI的免疫組化檢測結果 PDI表達于細胞胞質，顯微鏡下陽性反應呈棕黃色。YC和YM組PDI表達較強，細胞染色較深且細胞體積較大，YM組陽性細胞數多于YC組(P<0.05)。OC和OM組陽性細胞數較少，細胞體積較小，以OC組陽性細胞數量最少，與OM組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

箭頭示陽性細胞，下圖同

圖2 PDI在各組小鼠腦組織內的表達(×400)

2.3ERK和PDI的半定量統計結果 年輕組小鼠ERK和PDI的表達量多于老年組(P<0.05)。MLT可以增加小鼠腦內ERK和PDI的表達(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠ERK和PDI表達的半定量統計表

3 討 論

MLT是松果體分泌的一種吲哚類神經內分泌激素，其化學名稱是5-甲氧基-N-乙酰基色胺，1958年由Lerner及其同事首次從牛的松果腺中分離并鑒定〔4，5〕。MLT的血漿水平隨著年齡增長而發生相應變化，在幼兒期保持高水平，青春發育期開始下降，而后其水平在成年期保持恒定，直到老年期明顯下降。大量研究〔6，7〕證明，MLT具有明顯的抗衰老作用。外源性應用MLT可以推遲衰老〔8〕。

目前許多實驗〔9，10〕都證明了MLT強大的抗氧化作用，主要通過3個方面：一是直接與自由基結合，MLT是羥基的強消除劑，其消除能力是谷胱甘肽的4倍；二是減少體內自由基的產生，如MLT可以抑制NO合酶的活性，抑制NO的生成；三是提高體內抗氧化酶的活性。另外，MLT具有親脂性和親水性的雙極性分子特征，可以進入任何亞細胞結構、細胞和體液中，發揮抗氧化作用，從而有效地減少細胞凋亡〔11〕。本實驗結果提示MLT通過增強細胞內蛋白酶的活性，促進腦組織新陳代謝，起到保護腦組織、延緩衰老的作用。

ERK分為ERK1和ERK2，是90年代初期先后被分離鑒定的一種蛋白激酶，它們有90%的同源性。ERK為脯氨酸導向的絲氨酸 /蘇氨酸激酶，可以使脯氨酸相鄰的絲氨酸 /蘇氨酸磷酸化。靜止狀態下ERK定位于胞質，當其激活后轉位至胞核，調節轉錄因子活性，產生相應的細胞效應。ERK可以活化抗凋亡分子同時刺激表達存活相關基因從而產生抗凋亡作用。本實驗結果提示MLT可能通過增加ERK的活性來減少腦組織的凋亡反應。

PDI廣泛存在于內質網管腔中，是蛋白質二硫鍵異構酶，又是內質網分子伴侶家族重要成員。作為折疊酶PDI可催化蛋白質分子中二硫鍵的形成，作為分子伴侶PDI在蛋白質翻譯及翻譯后轉運中起著重要的作用。PDI可以識別未折疊或部分折疊的新生肽折疊中間物的非天然結構，或變性蛋白在重折疊過程中形成的折疊中間物的非天然結構，通過其多肽結合部位與之結合，防止靶蛋白或底物蛋白之間錯誤的結合和聚合〔12〕。衰老的機體PDI合成減少，異常折疊蛋白質增多，更易于發生疾病、加速衰老。通過本實驗發現MLT能夠增加年輕組與年老組PDI的表達，減少錯誤折疊蛋白質的形成，從而有效延緩機體衰老。

MLT除了具有清除自由基、抗氧化、抗應激、抑制凋亡與延緩衰老等生物學作用外，尚有增強免疫、校準生物鐘〔13〕、抑制腫瘤生長〔14〕和調節其他內分泌的作用。因此，MLT的應用前景非常廣闊，有望臨床常規應用于預防與治療神經退化性疾病及其他年齡相關疾病。

4 參考文獻

1Reiter RJ,Tan DX,Allegra M. Melatonin: reducing molecular pathology and dysfunction due to free radicals and associated reactants〔J〕.Neuroendocrinol Lett,2002;23(Supp1):3 -8.

2Michal Karasek.Does melatonin play a role in aging processes〔J〕.Physiol Pharmacol,2007;58(3):105-13.

3Bondy SC,Sharman EH.Melatonin and the aging brain〔J〕.Neurochem Int，2007;50(4):571-80.

4Morgan PJ,Hazlerigg DG. Photoperiodic signalling through the melatonin receptor turns full circle〔J〕.J Neuroendocrinol,2008;20(1): 820- 6.

5Oliver Rawashdeh,Erik Maronde. The hormonal Zeitgeber melatonin: role as a circadian modulator in memory processing〔J〕.Front Mol Neurosci,2012;5(27):1-6.

6Bubenik GA,Konturek SJ. Melatonin and aging:prospects for human treatment〔J〕.J Physiol Pharmacol,2011;62(1):13-9.

7Cardinali DP,Esquifino AI,Srinivasan V,etal.Melatonin and the immune system in aging〔J〕.Neurol Immunol Modul,2008;15(12):272-8.

8Cardinali DP,Furio AM,Brusco LI. Clinical aspects of melatonin intervention in Alzheimer's disease progression〔J〕.Curr Neuropharmacol,2010;8(5): 218-27.

9Bonnefont-Rousselot D,Collin F. Melatonin:action as antioxidant and potential applications in human disease and aging〔J〕.Toxicology,2010;278(11):55-67.

10Pozo MJ,Gomez-Pinilla PJ,Camello-Almaraz C,etal. Melatonin, a potential therapeutic agent for smooth muscle-related pathological conditions and aging〔J〕.Curr Med Chem,2010;17(12):4150-65.

11Ana Luisa Gutierrez-Valdez,Veronica Anaya-Martinez,Jose Luis Ordonez-Librado. Effect of chronic L-dopa or melatonin treatments after dopamine differentiation in rats:dyskinesia,motor performance, and cytological analysis〔J〕. ISRN Neurol,2012;8(10):1-16.

12王孟春，郭靜波，劉明華，等.蛋白質二硫鍵異構酶在幽門螺桿菌感染者胃粘膜中的表達及意義〔J〕.世界華人消化雜志，2006；14(29):2880-2.

13Park S,Lee SK,Park K,etal. Beneficial effects of endogenous and exogenous melatonin on neural reconstruction and functional recovery in an animal model of spinal cord injury〔J〕. J Pineal Res,2012;52(1):107-19.

14Grant SG，Melan MA,Latimer J,etal. Melatonin and breast cancer: cellular mechanisms, clinical studies and future perspectives〔J〕. Expert Rev Mol Med,2009;11： e5.