周圍神經缺血后GDNF表達的變化及與神經元凋亡的相關性

曾 靜 王本國

(中山市中醫院神經內科，廣東 中山 528400)

周圍神經損傷可以導致相應節段的脊髓和背根結神經元死亡，受損神經元的重要表現是神經元凋亡〔1，2〕。神經營養因子是一種可以促進神經細胞生長發育、保護神經細胞、預防神經細胞變性以及促進神經細胞再生的蛋白質。周圍神經缺血可以導致缺血的神經纖維發生變性，軸突的運輸速度減慢甚至停止，相關的神經元胞體發生變性〔3，4〕。但是周圍神經缺血導致神經纖維發生變性是否由于神經營養因子不足還未證實。本研究觀察周圍神經缺血后膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)表達的變化以及神經元凋亡的情況，并分析二者關系。

1 材料與方法

1.1動物模型制備 取成年健康Wistar大鼠36只，雌雄不限，體重210～250 g。隨機選擇Wistar大鼠的一側作為實驗側，另一側為對照側。將大鼠經腹腔麻醉后，從腹部進刀，將實驗側的髂總動脈后進行雙重結扎，對照側不做任何手術。

1.2切片制作 于大鼠術后3、5、7、14、21、28 d各取6只，經腹腔麻醉后，開胸行升主動脈插管，并用多聚甲醛固定。然后經后入路取L4～L6脊髓節段以及雙側4～6腰脊神經節，保存于固定液中，24 h后用乙醇脫水，石蠟包埋，連續切片，每隔5張取1張切片，切片厚度為5 μm，每組標本收集5套切片備用。

1.3TUNEL法測細胞凋亡 參照試劑盒內說明書方法對大鼠術后3、5、7、14、21、28 d切片金星原位末端標記，計數陽性細胞，計算細胞的凋亡率(陽性細胞染色為棕黃色)。

2 結 果

2.1神經元凋亡情況 凋亡的神經元胞體體積會腫脹或者縮小，且凋亡細胞核呈深黃色或棕黃色，且位置偏移，部分神經元會變小、固縮。通過TUNEL法檢測發現運動神經元的凋亡率在術后3 d時沒有明顯的變化，在5 d時凋亡率較對照側顯著升高，且凋亡率在術后14 d時達到高峰，隨后逐漸下降，但是在觀測的時間內仍然高于對照側。而感覺神經元在術后3 d就發生明顯的凋亡，在術后7 d時達到高峰，而到觀測時間的28 d時降至對照側水平，并且通過電鏡觀察發現凋亡的神經元在腰髓前角散在分布，且在背根節處也散在分布于周邊。見表1。

表1 運動神經元和感覺神經元的凋亡率

2.2GNDF的表達情況 通過免疫組化染色檢測發現，運動神經元中GDNF的表達陽性率在術后3 d明顯增高，然后逐漸降低，到14 d時與對照側相比差異無統計學意義；而感覺神經元的變化趨勢則與運動神經元相同；實驗側的部分神經元胞體發生腫脹，并且細胞核偏位，神經髓鞘中施萬細胞著色較對照側增多，而神經元周圍的膠質細胞僅有部分著色。表達GDNF的神經元細胞大多都是中等細胞，還有少量的大型細胞。免疫組化陽性的染色后呈棕黃色，顆粒狀，大小不等。見表2。

表2 膠質細胞GDNF的表達陽性率

3 討 論

在發育過程中，決定神經元凋亡的重要原因是神經元是否與外界靶器官建立神經調控通路〔5，6〕。有研究發現，成年大鼠的坐骨神經被切斷，腰髓前角的運動神經元和感覺神經元會發生凋亡，且運動神經元死亡占41%，感覺神經元死亡占29%〔5，7，8〕。 本研究發現，切斷大鼠的坐骨神經后，坐骨神經相關血管的缺血會引起相關節段神經元胞體發生結構上的變化，并且在術后的7～14 d最為明顯。在顯微鏡下可以看到神經元胞體內線粒體腫脹，內質網擴張，甚至核膜溶解、破裂等現象〔9〕。由于這些細胞器發生了嚴重的病理變化，不能發揮正常水平的功能，無法為軸突再生提供充分的營養物質〔10〕。并且本研究結果說明腰髓節段的運動神經元出現損傷的時間較感覺神經元較晚，但是其持續時間較長，呈漸進性損傷。而感覺神經元細胞凋亡發生的時間較早，且嚴重程度也較高，說明坐骨神經缺血對感覺神經元的影響較大，此結果與臨床上缺血性神經病的癥狀相符。神經細胞中胞體和軸突之間的聯系非常密切，是一個形態和功能的整體。神經元維持正常的生理功能依賴于神經纖維的軸漿運輸。如果軸突出現損傷，神經元胞體也必然受損，繼而影響神經的修復和再生〔11，12〕。本研究發現運動神經元的凋亡率較感覺神經元的凋亡率較低，可能是因為其與其他神經元、組織的聯系廣泛，且軸突、樹突較多，相互之間的關聯較密切，而感覺神經元維持正常的生理功能對靶器官來源的神經營養因子依賴性較大。臨床上周圍神經缺血的疾病發生率較高，并且患者通常在短時間內即出現神經傳導功能障礙，使得該神經支配的肢體感覺減退，運動功能障礙，大多預后與神經缺血的程度平行。而神經功能的恢復涉及多個方面，包括神經元軸突、效應器等。因此，研究在缺血損傷早期運動神經元和感覺神經元的變化對治療缺血性神經病有重要的意義。

4 參考文獻

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