腦缺血損傷中Notch信號(hào)通路活性的非配體依賴性改變及其作用

莽 靖 王姣琦 劉洪雨 李宗樹(shù) 楊 樂(lè) 胥桂華 何金婷 徐忠信

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130033)

經(jīng)典的Notch信號(hào)通路中，位于胞膜的Notch受體需要與鄰近細(xì)胞的配體結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)下游信號(hào)〔1〕。前期在單細(xì)胞系的體外研究中發(fā)現(xiàn)腦缺血損傷可誘導(dǎo)Notch1受體高表達(dá)〔2〕，而在非配體依賴的條件下，此種受體上調(diào)可否激活下游信號(hào)及其作用尚不明確。本研究應(yīng)用體外腦缺血損傷模型，觀察Notch1信號(hào)的非配體依賴性活性變化及其對(duì)神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞氧糖剝奪(OGD)損傷的影響，進(jìn)一步探討該通路參與腦缺血損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)分組 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞，按5×105～10×105/ml密度接種于6孔板，根據(jù)之前研究的方法建立神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞的OGD 12 h模型〔3〕，根據(jù)干預(yù)手段不同，分為對(duì)照組、Notch1-siRNA轉(zhuǎn)染組、OGD組、OGD+Notch1-siRNA轉(zhuǎn)染組，各組設(shè)3個(gè)平行對(duì)照孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2主要試劑及儀器 PC12細(xì)胞株購(gòu)自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，兔抗大鼠Notch1抗體(中杉金橋，北京)，兔抗大鼠Notch1胞內(nèi)段(NICD)抗體(葉舟生物，上海)，山羊抗兔IgG-HRP (碧云天，上海)，LipofecamineTM2000(Invitrogen，USA)，UNIQ-10 柱式Trizol 總RNA 提取試劑盒(Sangon，China)，Quantscript cDNA第一鏈合成試劑盒和RealMasterMix SYBR Green 試劑盒(TIANGEN，China)，熒光定量PCR儀(AB 7500 fast，USA)，流式細(xì)胞儀(Beckman-Epics-XL，USA)。

1.3siRNA -Notch1靶點(diǎn)的選擇、設(shè)計(jì)及合成 在Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索大鼠Notch1基因序列NM001105721，針對(duì)其編碼區(qū)設(shè)計(jì)3個(gè)干擾序列及1個(gè)陰性對(duì)照序(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物有限公司合成)沉默效果檢測(cè)后篩選出最佳序列行基因沉默。靶點(diǎn)序列：5′:CCCUGUCACUAUGGUUUGUTT3′;干擾序列：3′ACAAACCAUAUGGACAGGGTT5′。

1.4引物設(shè)計(jì) 根據(jù)之前研究的方法進(jìn)行Notch1引物設(shè)計(jì)〔2〕。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種至6孔板，24 h后行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞密度約80%；饑餓處理1 h，轉(zhuǎn)染5 h后棄上清；更換含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液48 h。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western印跡檢測(cè) 根據(jù)之前研究的方法行實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western印跡檢測(cè)〔2〕。

1.7流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 將細(xì)胞用0.25%胰酶消化后收集細(xì)胞，PBS 洗滌3次，加入結(jié)合液195 μl懸浮液及5 μl FITC-Annexin V，在室溫下避光孵育30 min；PBS 洗滌1次后重新懸浮細(xì)胞，加入5 μl碘化丙啶(PI)，在室溫避光孵育15 min，行FCM檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.0軟件行單因素方差分析和Studentt檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1OGD 12 h神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞Notch1受體mRNA表達(dá)及siRNA對(duì)其影響 與正常對(duì)照組(1.02±0.01)比較，Notch1-siRNA組Notch1 mRNA表達(dá)(0.34±0.02)顯著降低(P<0.05)，OGD組Notch1 mRNA表達(dá)(1.23±0.04)較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)；OGD+Notch1-siRNA轉(zhuǎn)染組Notch1 mRNA(0.39±0.04)較OGD組顯著降低(P<0.05)。

2.2OGD 12 h神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞Notch1及NICD蛋白表達(dá)檢測(cè)及siRNA對(duì)其影響 OGD組Notch1及NICD蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組均顯著升高(P<0.05)；OGD+Notch1-siRNA轉(zhuǎn)染組較OGD組顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表1。

表1 各組Nothc1及NICD蛋白表達(dá)相對(duì)定量

2.3OGD 12 h神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞凋亡率檢測(cè)及siRNA對(duì)其影響 與正常對(duì)照組(25.09%±1.22%)比較，OGD組細(xì)胞凋亡率(40.57%±0.80%)顯著升高(P<0.05)；與OGD組比較，OGD+Notch1-siRNA組細(xì)胞凋亡率(56.61%±1.50%)進(jìn)一步升高(P<0.05)，與正常對(duì)照組比較，Notch1 siRNA組細(xì)胞凋亡率(29.48%±0.84%)略升高，無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 Western印跡檢測(cè)Notch1及NICD蛋白表達(dá)

A: 正常對(duì)照組，B:Notch1-siRN A組，C:OGD組，D:OGD+ Notch1-siRN B組

3 討 論

Notch 信號(hào)通路廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，能通過(guò)細(xì)胞間相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡，此信號(hào)通路在多種器官和組織中廣泛表達(dá)〔4〕。課題組在前期工作中對(duì)該通路參與缺血性腦損傷機(jī)制進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)OGD損傷可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞Notch1受體表達(dá)上調(diào)，給予外源性配體Jagged1可加重其缺血缺氧性損傷〔2〕。前期研究結(jié)果雖然提示了Notch1信號(hào)通路可能參與缺血性腦損傷，但此種外源性的干預(yù)手段與體內(nèi)的真實(shí)環(huán)境差別較大。

在經(jīng)典的Notch1信號(hào)通路的激活過(guò)程中，Notch1受體的配體多存在于鄰近細(xì)胞表面，二者特異性結(jié)合后可催化Notch1受體的跨膜區(qū)發(fā)生蛋白裂解，NICD從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)釋放，直接進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮生物學(xué)作用。Notch配體與受體結(jié)合是Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活的必要條件，而NICD作為Notch蛋白的活化形式，其表達(dá)量則直接反映Notch信號(hào)通路的活化狀態(tài)〔1,5〕。

本研究結(jié)果一方面提示了OGD損傷可誘導(dǎo)Notch1信號(hào)通路激活，另一方面此種信號(hào)通路的激活是不需要依賴外源性配體的。近年來(lái)，這種受體在無(wú)特異性配體存在時(shí)，也可被選擇性激活現(xiàn)象正日益受到關(guān)注〔6〕，而在缺血性腦損傷中，Notch信號(hào)通路的這種非配體依賴的激活現(xiàn)象尚未見(jiàn)報(bào)道。Notch1受體作為鑲嵌在細(xì)胞膜上的一種結(jié)構(gòu)蛋白，其飽和性、親和性可能受到細(xì)胞外環(huán)境的影響〔7〕，而本研究結(jié)果提示OGD損傷可能不止影響細(xì)胞膜的通透性和流動(dòng)性，可能對(duì)Notch1受體的活性及親和力也發(fā)生了影響。而此種非配體依賴性的受體活化更為微觀的機(jī)制，有待于對(duì)OGD狀態(tài)下受體蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層中的空間構(gòu)型研究。

本文結(jié)果提示OGD損傷誘導(dǎo)的內(nèi)源性非配體依賴性Notch1通路激活，可能在腦缺血損傷過(guò)程中通過(guò)抗凋亡而發(fā)生神經(jīng)保護(hù)作用。而此種由OGD誘導(dǎo)非配體依賴性信號(hào)通路激活機(jī)制是Notch1信號(hào)通路特有的，還是有可能普遍存在于其他信號(hào)系統(tǒng)則需要深入研究。在缺血性腦損傷這一動(dòng)態(tài)變化的病理及病理生理過(guò)程中，Notch1信號(hào)通路在缺血不同時(shí)程可能發(fā)揮不同作用，其具體作用則需要對(duì)該通路在OGD不同時(shí)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。

4 參考文獻(xiàn)

1Schroeter EH, Kisslinger JA, Kopan R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain〔J〕. Nature, 1998; 393(6683):382-6.

2郭 娜,何金婷,胥桂華,等. Notch1受體在腦缺血損傷中表達(dá)變化及作用的體外研究〔J〕. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志, 2013;30(4):345-7.

3Chunli M, Jing M, Zhongxin X,etal. NGF combined with OGD induces neural ischemia tolerance in PC12 cells〔J〕. African J Biochem Res, 2011; 5(9):315-20.

4Greenwald I. Notch and the awesome power of genetics〔J〕. Genetics, 2012; 191(3):655-69.

5Nakazawa M, Ishii H, Aono H,etal. Role of Notch-1 intracellular domain in activation of rheumatoid synoviocytes〔J〕. Arthritis Rheum,2001; 44(7):1545-54.

6Deuel TF. Anaplastic lymphoma kinase: “Ligand Independent Activation” mediated by the PTN/RPTP signaling pathway〔J〕. Biochim Biophys Acta, 2013; 1834(10):2219-23.

7Dziewulska D, Rafaowska J. Role of endoglin and transforming growth factor-beta in progressive white matter damage after an ischemic stroke〔J〕. Neuropathology, 2006; 26(4):298-306.