不同時間腦缺血/再灌注損傷小鼠大腦Bcl-2和Caspase-3表達的變化

崔芳芹 楊衛東 陳前芬 趙云霞

(蚌埠醫學院病理生理學教研室，安徽 蚌埠 233030)

研究表明，腦缺血/再灌注損傷(CIRI)是大多數缺血性腦血管疾病的主要病理生理過程〔1〕，其發病機制尚不清楚，而細胞凋亡是CIRI最重要的機制之一〔2〕。目前認為Bcl-2是最重要的抗凋亡基因，具有抑制凋亡的作用。Caspase-3是促凋亡基因，是所有凋亡途徑的最后效應子，它們均在成熟腦組織中有少量表達。Bcl-2和Caspase-3表達的改變，將影響缺血神經元的存活或死亡。再灌注損傷與缺血時間有很強的依賴關系，其缺血時間過短或過長，都不會造成嚴重的CIRI；只有在一定缺血時間段內，恢復血供則易導致嚴重的CIRI。本實驗觀察不同缺血時間所引起的再灌注損傷小鼠腦神經元細胞Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達的變化。

1 材料與方法

1.1試劑 Bcl-2和Caspase-3的抗體和SP免疫組化試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2動物與分組 健康昆明種小鼠50只，體重(25±5)g，雌雄兼用，由我院實驗動物科提供，隨機均分為五組。假手術組:僅行手術，不實施腦缺血；缺血-再灌注(I/R)Ⅰ組:缺血30 min，再灌注1 h；I/RⅡ組:缺血60 min，再灌注1 h；I/RⅢ組: 缺血90 min，再灌注1 h；I/RⅣ組:缺血120 min，再灌注1 h。上述全腦CIRI動物模型的建立，均采用我室改進的小鼠全腦CIRI的動物模型〔3〕，且在10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)小鼠腹腔注射麻醉后進行。

1.3標本制備 各組動物動態觀察到預定的時間后，用20%烏拉坦過量麻醉處死，開顱，取出小鼠大腦，用10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，48 h 后于乳頭體及視交叉平面行冠狀切開，制成腦組織切片(厚度為3 μm)。

1.4免疫組織化學染色 采用免疫組織化學SP法染色：①石蠟切片常規脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液修復；②3%H2O2，37℃孵育15 min；③山羊血清封閉，37℃孵育30 min，勿洗；④一抗為兔抗鼠Bcl-2和Caspase-3抗體，稀釋濃度均為1∶100，4℃過夜；⑤ 37℃孵育30 min；⑥二抗為生物素標記的山羊抗兔的IgG，37℃孵育15 min；⑦辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37℃孵育30 min；⑧以上各步驟之間都磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次×5 min；⑨ DAB顯色3 min，自來水沖洗；⑩蘇木精復染2 min，自來水沖洗，脫水，透明和封片。用PBS替代第一抗體作為陰性對照。

1.5計算機圖像分析 在10×40倍光鏡下，利用Nikon彩色數碼CCD攝像頭捕獲各組免疫組化染色切片中Bcl-2和Caspase-3的圖像，每張切片隨機選取5個視野，再用metamorph生物圖像軟件計算各組Bcl-2和Caspase-3免疫陽性細胞的平均光密度(MOD)值。

2 結 果

2.1免疫組織化學染色結果 在各組小鼠腦組織Bcl-2和Caspase-3免疫組織化學染色切片中，高倍鏡下，可見假手術組Bcl-2和Caspase-3免疫反應陽性物主要沉積在大腦上皮神經元細胞的胞質內，呈淺棕色，細胞核呈陰性反應；I/RⅠ組腦神經元細胞內Bcl-2和Caspase-3表達較假手術組增強，呈棕黃色；I/RⅡ組腦神經元細胞內Bcl-2和Caspase-3表達較假手術組明顯增強，呈棕褐色；I/RⅢ組腦神經元細胞內Bcl-2表達較I/RⅡ組明顯減少；I/RⅣ組腦神經元細胞內Bcl-2表達I/RⅡ組顯著減少；I/RⅢ組腦神經元細胞內Caspase-3表達較假手術組顯著增強，呈深棕色；I/RⅣ組腦神經元細胞內Caspase-3表達I/RⅢ組顯著減少，呈棕色。見圖1，圖2。

圖1 小鼠腦神經元細胞內Bcl-2表達(SP法，×400)

圖2 小鼠腦神經元細胞內Caspase-3表達(SP法，×400)

2.2計算機圖像分析結果 在一定缺血時間范圍內，Bcl-2隨缺血時間的延長而表達增加，其中I/RⅡ組Bcl-2的MOD值分別與假手術組和I/RⅠ組比較，均有顯著差異(P<0.05)；但缺血時間進一步延長，I/RⅢ組和I/RⅣ組Bcl-2表達逐漸減少，分別與I/RⅡ組的MOD值比較均有顯著差異(P<0.05)。Caspase-3表達隨著缺血時間的延長而不斷增加，I/RⅠ組、I/RⅡ組和I/RⅢ組Caspase-3的MOD值分別與假手術組比較，差異均有顯著性(P<0.05)；I/RⅡ組和I/RⅢ組Caspase-3的MOD值分別與I/RⅠ組比較均有顯著差異(P<0.05)；I/RⅡ組和I/RⅢ組Caspase-3的MOD值相互比較有顯著差異(P<0.05)；但缺血時間過久，I/RⅣ組Caspase-3減弱，與I/RⅢ組Caspase-3的MOD值比較有顯著差異(P<0.05)。見表1。

表1 五組小鼠腦神經元細胞內Bcl-2和Caspase-3的MOD值比較

3 討 論

據WHO調查表明腦血管意外引起的死亡率占所調查的57個國家死亡總人數的11.3%, 僅次于癌癥和心肌梗死，腦缺血是腦血管疾病最主要的病種, 在我國其死亡率僅次于惡性腫瘤, 嚴重危害人類的健康〔4〕。目前對腦缺血性疾病的防治，仍然是全社會和醫學界關注的重要課題〔5〕。CIRI是大多數缺血性腦血管疾病的主要病理生理過程，其發病機制不是很清楚，主要有自由基學說、鈣超載學說、線粒體功能障礙及遲發型神經元死亡(DND)學說等〔6〕。腦缺血后缺血中心區域的神經元很快出現死亡，但其周圍的神經元卻發生遲發性神經元死亡，已證明這種遲發性死亡主要是細胞凋亡，它的發生受許多細胞外因素和細胞內基因的調節〔3〕；如何減輕CIRI缺血半暗帶區的細胞凋亡，對缺血性腦血管疾病患者的預后具有決定性的作用。目前認為Bcl-2基因家族在凋亡中發揮重要作用, Bcl-2在腦內的過量表達可增強腦組織對缺血性損傷的耐受性, Bcl-2可以通過與Bax競爭結合, 形成異源二聚體, 封閉Bax形成孔道的活性, 阻止ctyc穿過線粒體膜進入細胞質, 從而抵抗細胞凋亡〔7〕，因此調節其基因表達對腦缺血具有重要的治療潛力。近年研究發現，Caspase 家族在凋亡過程中起重要作用，凋亡的最后過程是通過Caspase 的激活而實現的〔8〕。Caspase-3是參與凋亡Caspase 級鏈反應最終效應子，在蛋白酶級聯切割過程中處于核心位置，在正常情況下以無活性的酶原形式存在于胞質中，在凋亡的早期階段不同的蛋白酶切割Caspase-3 酶原，從而激活Caspase-3；活化的Caspase-3又進一步切割不同的底物，導致蛋白酶級聯切割放大，最終使細胞死亡。Caspase-3 是多種凋亡途徑的共同下游效應部分，細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路，在凋亡的信息傳遞中居于核心地位，因此Caspase-3在細胞凋亡早期啟動與執行過程中起重要作用〔9〕，是細胞凋亡發生的關鍵酶。

缺血后再灌注可能造成更嚴重的損傷，但并不是所有缺血的器官在血流恢復后都會發生CIRI，許多因素可以影響其發生及其嚴重程度，其中最主要的因素是缺血時間。缺血時間短，恢復血供后可無明顯的再灌注損傷，因為所有器官都能耐受一定時間的缺血。缺血時間長，恢復血供則易導致CIRI；若缺血時間過長，缺血器官會發生不可逆性損傷。再灌注損傷與缺血時間的依賴關系，提示在缺血過程中組織發生的某些變化，是再灌注損傷發生的基礎，再灌注損傷的實質就是將缺血期的可逆性損傷經恢復血流后進一步加重或轉化為不可逆性損傷。本實驗研究發現Bcl-2、Caspase-3在正常的腦神經元細胞的胞漿內均有少量的表達。I/RⅢ、I/RⅣ組隨著缺血時間的進一步延長，而Bcl-2的表達越來越弱，這可能與腦組織長時間缺血導致細胞能量代謝障礙有關〔2〕。Caspase-3 的活化是細胞凋亡的早期生物化學指標，并與細胞凋亡的形態學表現相互關聯〔10〕。

綜上，在缺血后的受損神經元中, 凋亡啟動和凋亡抑制基因均有上調, 凋亡啟動基因代表細胞死亡趨勢, 凋亡抑制基因過度表達代表內源性神經保護機制。若早期應用Caspase 抑制劑，能有效抑Caspase 活性的增加，減少神經細胞的凋亡，改善神經細胞功能〔11〕。在細胞凋亡過程中，Bcl-2及其家族成員起重要作用，它們共同構成一個非常復雜的相互作用網絡，抑制細胞凋亡，在腦缺血早期采用積極的方法促進Bcl-2基因的表達，可能會減輕神經系統的損害〔12〕。

4 參考文獻

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