N-乙酰半胱氨酸對人離體嗜中性粒細胞細胞內活性氧和TLR4表達的影響

王春雷 呂 飛 張 燁

(中國醫科大學附屬第一醫院老年內科，遼寧 沈陽 110001)

目前對特發性肺間質纖維化(IPF)的治療尚無確實、有效的方法，主要藥物糖皮質激素、免疫抑制劑藥物、抗氧化劑和細胞因子拮抗劑等〔1〕。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是一種較強的抗氧化劑，研究發現的NAC可能通過膜受體通道抑制細胞內的蛋白激酶C及其上游的蛋白質激酶，抑制中性白細胞釋放超氧陰離子的產生〔2〕。臨床研究結果也表明，NAC對IPF的肺功能惡化有明顯延緩作用，改善肺活量和彌散功能，尤其常規劑量的3倍以上(600 mg/d)，但其具體機制尚不明了〔3〕。Toll樣受體(TLRs)是新近發現的先天性免疫系統中的細胞跨受體，能夠識別病原體相關分子和損傷相分子，其中 TLR4在炎癥反應中的作用尤為顯著〔4，5〕，最近研究發現TLR4在動物急性或慢性炎癥和肺間質纖維化的發病中起到重要作用〔6〕。本研究探討NAC對人離體嗜中性粒細胞細胞內活性氧(ROS)水平和TLR4表達的影響。

1 材料與方法

1.1試劑 LPS及NAC購自美國Sigma公司；人嗜中性粒細胞分離試劑盒購自加拿大的Stemcell公司；單克隆MyD88和β-actin 購自美國的Cell Signaling公司；二抗過氧化物酶標記的兔抗鼠免疫球蛋白G抗體購買于美國Laboratories公司。Ficoll 購自美國的GE公司。其他所有試劑均為分析級。

1.2密度梯度離心法分離嗜中性粒細胞 用密度梯度法分離正常健康人外周靜脈血的嗜中性白細胞。用Krebs-Ringer-phosphate 緩沖液(KRP；pH 7.4)沖洗細胞三次〔7〕；細胞計數使上述緩沖液中含嗜中性粒細胞數為1×106cells/ ml。

1.3用流式細胞儀方法測定細胞內氧自由基 用流式細胞儀測定不同濃度(50，100，150，200 μmol/L)NAC對嗜中性粒細胞產生ROS的影響。在RPIM 1640培養基中加入上述分離細胞3×106，用10 μmol/L的 5-(and-6) -chloromethyl-29，79-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，acetyl ester (CM-H2DCFDA)處理10 min，再用1 μg/ml LPS和上述濃度的NAC處理細胞10 min。用PBS緩沖液沖洗細胞二次。用ROS熒光探針二氫乙啶 (DHE)染色，應用流式細胞儀檢測(CA)，激發波長：488 nm，發射波長：530 nm。LPS的熒光值為基礎值100%〔8〕。每個試驗做5次，取平均值。

1.4Western印跡法檢測嗜中性粒細胞MyD88磷酸化的水平 1 ml的KRP預處理上述嗜中性粒細胞(1×106個/ ml)后，37℃下用1 μg/ml LPS孵化嗜中性粒細胞3 min ，加入不同濃度(50，100，150，200 μmol/L)的NAC，用45%三氯醋酸0.5 ml終止反應(最終濃度為15%)。置于冰中反應30 min后，在4℃下離心30 min，用1∶1(容量比)乙醚和乙醇的混合液沖洗三次，每個試管中加入蛋白質溶解液(pH6.8)50 μl。用12% SDS-PAGE分離蛋白質〔7〕，用轉寫儀轉寫到PVDF上，用5%蛋白液沖洗PVDF膜3次。用特異性抗原抗體反應檢測骨髓樣分化因子88(MyD88的磷酸化)。免疫熒光劑(ECL)檢測蛋白質磷酸化。

2 結 果

2.1NAC對人離體嗜中性粒細胞釋放超氧陰離子的作用 NAC呈劑量依賴性抑制LPS誘導的人嗜中性粒細胞ROS的產生，濃度為50和100 μmol/L時，可明顯抑制ROS的產生可達到(80.1±5.5)%和(55.0±6.5)%，隨著濃度的增加，抑制越明顯，在濃度為150和200 μmol/L時，分別可達到(42.1±9.7)%和(30.2±13.3)%(P<0.01)。

2.2NAC對人離體嗜中性粒細胞MyD88磷酸化的影響 LPS可增加嗜中性粒細胞蛋白質MyD88的磷酸化，NAC呈劑量依賴性抑制LPS誘導的人嗜中性粒細胞MyD88的磷酸化，濃度為50和100 μmol/L時，抑制程度達到(85.5±5.9)%、(51.7±7.8) %(P<0.01)，隨著濃度的增加，抑制越明顯，在濃度為150和200 μmol/L時，分別可達到(30.6±12.3) %和(10.2±3.3) %(P均<0.01)。NAC也呈劑量依賴性抑制MyD88的磷酸化，與抑制ROS相平行。見圖1。

1～6：空白組、LPS組、50、100、150、200 μmol/L NAC組

3 討 論

NAC為呼吸道黏液溶解劑，作用機制是分子中的巰基能使痰中黏蛋白的二巰鍵斷裂，使黏蛋白分解，對脫氧核糖核酸纖維亦有裂解作用。近年研究表明NAC和各種抗氧化藥物一樣可恢復人體內耗竭的抗氧化劑水平，保護肺臟不受氧自由基的損傷。NAC具有抗炎作用，可抑制嗜中性粒細胞的功能，包括直接抑制黏附分子的表達和細胞遷移〔9〕。

肺纖維化的早期肺泡上皮細胞受損，就釋放血小板衍生因子PDGF、轉化生長因子TGFα、TGFβ、內皮素-1，PGF2。Ⅰ型上皮細胞受損，Ⅱ型上皮細胞增生。中性粒細胞到達肺內后，短時間內就可釋放氧自由基，彈性硬蛋白酶、組織蛋白酶和膠原酶等，能損傷肺組織。嗜中性粒細胞通過模式識別受體識別微生物的代謝產物，其中 TLR4主要通過MyD88依賴性途徑和非MyD88依賴性途徑激活下游的激酶，前者可激活NF-κB和MAPK信號通道，與嗜中性粒細胞釋放超氧陰離子有關〔10〕。本研究發現抗氧化劑NAC可以通過抑制人嗜中性粒細胞TLR4-MyD88的表達，抑制細胞內ROS的產生。結合以前的研究〔2，11〕，認為NAC可能通過抑制人嗜中性粒細胞TLR4，從而抑制NADPH氧化酶亞單位p47phox的磷酸化和氧自由基的產生，與NAC的抗氧化作用可能與治療肺間質纖維化有關。

4 參考文獻

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11王春雷,康 健，李振華.還原型輔酶Ⅱ氧化酶蛋白亞單位在特發性肺纖維化患者中的表達〔J〕.中華結核和呼吸雜志，2007；30(4)：265-8.