瑞舒伐他汀聯(lián)合氯沙坦對氧化修飾低密度脂蛋白誘導的人單核-巨噬細胞組織因子表達的影響及機制

趙 豐 宋海彬 張 羽 申曉彧

(山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)院心血管內科，山西 太原 030001)

冠狀動脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定轉為不穩(wěn)定、破裂進而形成血栓，是急性冠脈綜合征最主要的發(fā)病機制〔1〕。冠狀動脈損傷后啟動凝血瀑布反應形成血栓，組織因子(TF)參與了此重要過程。有實驗證實〔2〕，氧化修飾低密度脂蛋白(ox-LDL)作用于巨噬細胞，大多數(shù)的巨噬細胞發(fā)生凋亡并表達TF。瑞舒伐他汀作為新一代HMG-CoA還原酶抑制劑，可明顯下調低密度脂蛋白、甘油三酯及升高高密度脂蛋白， 氯沙坦是廣泛用于臨床的長效血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)，臨床上兩藥常聯(lián)合使用應用于冠心病的二級預防。兩藥聯(lián)合能否進一步降低TF mRNA和蛋白的表達，國內外文獻未見報道。本實驗旨在研究瑞舒伐他汀聯(lián)合氯沙坦對ox-LDL誘導的單核-巨噬細胞TF mRNA和蛋白表達的影響并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 健康成人靜脈血來自山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)院體檢中心；人淋巴細胞分離液(Lymphocytes Separation Medium1077)為上海華精生物高科技有限公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)液；胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；ox-LDL為北京協(xié)生生物科技有限公司產(chǎn)品；佛波酯為美國SIGMA公司產(chǎn)品;FITC-CD14抗體購自日本Beckman Coulter公司；超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture(with Rox)、Dnase1 均購自北京康為世紀生物科技有限公司；TRIzol購自天根生化科技有限公司；引物序列由上海生工生物有限公司合成；瑞舒伐他汀為阿斯利康公司饋贈；氯沙坦為默沙東公司饋贈。

1.2人單核細胞的分離 取新鮮的健康人靜脈血30 ml，普通肝素抗凝后分到10個試管中。用RPMI-1640液稀釋1倍后，充分吹打混勻，分別緩慢加入有等比例淋巴細胞分離液的離心管中，離心2 000 r/min，20 min后，吸取中間環(huán)狀云霧狀淋巴細胞層，再用PBS緩沖液3 ml充分混勻，1 500 r/min離心洗滌2次。取含10%胎牛血清RPMI-1640各5 ml，將試管中的細胞吹開混勻，然后將細胞懸液分別加入培養(yǎng)瓶中。于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中靜置孵育，培養(yǎng)至4代后，取指數(shù)生長期細胞用于誘導轉化實驗。

1.3人單核細胞來源的巨噬細胞的誘導轉化、培養(yǎng)與鑒定 向單核細胞培養(yǎng)基中加入160 nmol/ml的佛波脂無胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，待細胞轉化為巨噬細胞后用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次。將細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，細胞由懸浮生長變?yōu)橘N壁生長，且伸出偽足。臺盼藍染色測定細胞存活率>95%。采用特異熒光素標記的CD14細胞表面抗體行流式細胞儀鑒定巨噬細胞。

1.4試驗分組 試驗共分4個組。ox-LDL對照組，單核-巨噬細胞培養(yǎng)基中加入ox-LDL 50 μg/ml孵育48 h；瑞舒伐他汀組，ox-LDL 50 μg/ml孵育2 h后，加入瑞舒伐他汀0.1 μmol/L培養(yǎng)48 h；氯沙坦組，ox-LDL50 μg/ml孵育2 h后，加入氯沙坦0.001 mmol/L培養(yǎng)48 h；ox-LDL 50 μg/ml孵育2 h后，加入瑞舒伐他汀0.1 μmol/L聯(lián)合氯沙坦0.001 mmol/L培養(yǎng)48 h。

1.5各組TF mRNA表達水平檢測 棄培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入1.0 ml Trizol，依次加入氯仿、異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌后略晾干，溶于30 μl RNase-free 水中。取5 μl RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定RNA；反轉錄反應 用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄，反轉錄反應在20 μl體系中進行：含Primer mix 2 μl、RNA Template 2 μl、RT Mix，5×4 μl，HiFi-MMLV Enzyme Mix 1 μl、RNase-Free 水11 μl。于PCR儀上42℃反應1 h，70℃滅活10 min。得到的cDNA可在-20℃保存；TF上游引物序列：5′-CCGACGAGATTGTGAAGGATGTG-3′，下游序列：5′-TTGTT- GGCTGTCCGAGGTTTGT-3′。PCR反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s，循環(huán)40次。β-actin上游引物序列：5′-CCTGAGGCACTCTTCCAG-3′，下游引物序列：5′-TCACACTTCATGATGGA-3′，產(chǎn)物大小100 bp；結果分析：反應完成后即得Ct值。mRNA表達相對量用2-ΔΔCt表示，其中ΔΔCt=(Ct靶基因-Ct內參)處理組-(Ct靶基因-Ct內參)未處理組，以ox-LDL組為未處理組。

1.6TF蛋白含量測定 取六孔培養(yǎng)板的上清液進行ELISA測定，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行，每組重復4次。

2 結 果

2.1PCR產(chǎn)物的確定分析 TF基因RT-PCR產(chǎn)物的融解曲線峰值為82.5℃。融解曲線無切跡，鋒線銳利，證實其RT-PCR產(chǎn)物特異性強，無異常擴增。

2.2對ox-LDL誘導人單核-巨噬細胞TF mRNA表達影響 瑞舒伐他汀組、氯沙坦組與ox-LDL組比較，TF mRNA表達減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。瑞舒伐他汀聯(lián)合氯沙坦組與瑞舒伐他汀組、氯沙坦組比較，TF mRNA表達減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且二者具有協(xié)同作用。見表1。

2.3對ox-LDL誘導人單核-巨噬細胞TF蛋白表達的影響 瑞舒伐他汀組或氯沙坦組與ox-LDL組比較，TF蛋白表達減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。瑞舒伐他汀聯(lián)合氯沙坦組與瑞舒伐他汀組、氯沙坦組比較，TF蛋白表達減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且二者具有協(xié)同作用。見表1。

表1 各組TF mRNA、TF蛋白表達水平

3 討 論

ox-LDL引起的內皮損傷或激活單核細胞和內皮細胞釋放炎癥介質參與了動脈粥樣硬化(AS)形成。ox-LDL是一種強烈的細胞活化劑，可強有力的促進單核細胞的增殖，同時可刺激單核細胞表達TF和增強促凝活性。有研究報道，ox-LDL通過增加TF mRNA及蛋白表達水平，導致凝血和纖溶的動態(tài)失衡，使凝血活性增高，纖溶活性下降〔3〕。

TF是重要的凝血和纖溶調節(jié)因子，兩者表達異常時，正常的凝血和(或)纖溶平衡破壞，易導致血栓形成。Taubman等〔4〕認為病變區(qū)TF和纖溶酶原激活物抑制物主要由巨噬細胞合成，隨著病變的進展,TF的量逐漸增加。本研究前期試驗表明，ox-LDL可誘導單核-巨噬細胞表達組織因子和增強促凝活性,而且證明這種促凝活性是由TF啟動的。培養(yǎng)液中加入瑞舒伐他汀可抑制由ox-LDL誘導的單核-巨噬細胞TF抗原的表達和促凝活性。

研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物不僅是有效的降血脂藥，同時還具有不依賴降脂作用的抗血栓和改善血管內皮功能的作用〔5〕。體內研究證實〔6，7〕，他汀類可抑制細胞內TF表達及活性，對凝血和纖溶功能紊亂具有良好的調節(jié)作用。Markle等〔8〕研究普伐他汀對人血管細胞凝血和纖溶功能的影響，發(fā)現(xiàn)普伐他汀明顯減少ox-LDL誘導的TF表達及蛋白產(chǎn)生，從而調節(jié)凝血和纖溶的動態(tài)平衡，減少不穩(wěn)定斑塊處血栓形成。本研究前期實驗表明ox-LDL可能使單核-巨噬細胞LOX-1受體蛋白、TF蛋白的表達和分泌增加。而加入瑞舒伐他汀后LOX-1 mRNA和蛋白、TF mRNA和蛋白的表達明顯下降，表明瑞舒伐他汀可能通過LOX-1途徑降低TF mRNA。

Nagata等〔9〕研究證明外源性AngⅡ增加體外培養(yǎng)的人單核細胞的TF mRNA和蛋白表達?？ㄍ衅绽涂驳厣程棺钄鄦魏思毎麅仍葱缘哪I素血管緊張素系統(tǒng)，可減少單核胞TF mRNA和蛋白的表達，同時減少TNF-α mRNA和蛋白的表達，說明腎素血管緊張素統(tǒng)與TF的合成有直接聯(lián)系，或者通過TNF-α來調節(jié)TF的表達〔10，11〕。Napoleona等〔12〕的研究證明卡托普利、福辛普利、伊普利和洛沙坦減少內毒素刺激的單核細胞的TF活性。他們同時對作用機制進行了探討，證明卡托利在轉錄水平抑制TF的表達。本實驗發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀聯(lián)合氯沙坦TF mRNA表達下調更為明顯，其機制可能，瑞舒伐他汀聯(lián)合氯沙坦可能分別通過阻斷LOX-1表達和阻斷AT1受體使TF的表達減少，兩者聯(lián)合加強了這一作用，ELISA的結果又從蛋白水平證實了上述關于TF表達情況的推論。

綜上，ox-LDL可使人單核-巨噬細胞TF的表達增多，降低動脈粥樣硬化斑塊中繼發(fā)性血栓形成，減少急性冠脈綜合征的發(fā)生，兩者聯(lián)合可通過協(xié)同作用使上述效應進一步放大。

4 參考文獻

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