創傷性顱腦損傷模型大鼠促紅細胞生成素及其受體的表達及意義

李 偉

(鐵道警察學院公安技術系,河南 鄭州 450053)

創傷性顱腦損傷是危害人類健康及生活質量的常見疾病之一〔1〕。促紅細胞生成素(EPO)是一種對神經具有保護以及營養作用的細胞因子，廣泛表達在中樞神經系統。近年來研究表明，在外傷所致的顱腦損傷中，EPO及EPD受體(EPOR)的表達與神經保護密切相關〔2,3〕。在缺血缺氧的條件下，EPO的表達顯著升高，但EPO、EPOR在疾病中的動態變化仍少見報道。本研究擬探討EPO、EPOR在腦外傷中的意義。

1 材料與方法

1.1動物模型以及實驗分組 由揚州大學實驗動物比較醫學中心提供的48只SD雄性大鼠，體重為230～250 g，隨機分為8組，分別為正常對照組、假手術組、顱腦損傷后2、6、12、24 h、3、7 d組，每組6只。實驗組大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，按照文獻方法建立大鼠顱腦損傷模型。假手術組大鼠同樣麻醉后手術，但不接受撞擊。

1.2標本采集 各組大鼠分別于創傷后2、6、12、24 h、3、7 d處死，假手術組于術后2 d處死，取以損傷灶為中心的腦皮質，直徑約為5 mm，于液氮中凍存。

1.3實時定量PCR檢測 抽提RNA，設計EPO以及EPOR的引物，進行逆轉錄，以cDNA為模板進行PCR。PCR條件：50℃ 30 min，95℃ 15 min，94℃ 50 s，58℃ 1 min，72℃ 1 min，共35次循環，72℃終末延伸。β-actin上游引物5′-TCCTATGTGGGTGACGAGGC-3′；上游引物5′-TACATGGCTGGGGTGTTGAA-3′；擴增長度245 bp；Tm值58℃，EPO上游引物5′-ATTTGCGACAGTCGCGTTCT-3′；下游引物5′-GTATCCGCTTGAAGTGTTCG-3′，擴增長度395 bp，Tm值58℃；EPOR上游引物5′-CTATGGCTGTTGCAACGCGA-3′，下游引物5′-CCGAGGGCAGGAGCTTAG-3′，擴增長度402 bp，Tm值58℃。

1.4Western 印跡檢測EPO、EPOR的含量 腦組織超聲裂解，提取總蛋白，電泳轉膜封閉后加入一抗，4℃孵育過夜，加入二抗，于凝膠成像系統下分析，內參照為β-actin，蛋白表達量= 靶蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。

2 結 果

2.1Realtime PCR結果 與正常對照組相比，EPO mRNA水平在傷后24 h內升高，第3天達到高峰，至傷后第7天下降；而EPOR從2 h就開始升高，到24 h達到高峰，到損傷后第3天開始下降，但是傷后7 d時仍然維持在較高的水平，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2Western 印跡結果 與正常組相比，創傷性顱腦損傷模型組的EPO在創傷后24 h達到高峰，然后逐漸降低，而EPOR在創傷后早期即大量增加，并在達到高峰后一直維持在較高的水平，見圖1、表1。

表1 各組大鼠腦皮質中EPO、EPOR mRNA蛋白表達量

圖1 各組大鼠腦皮質EPO、EPOR蛋白Western 印跡圖

3 討 論

在顱腦損傷后存活的患者中，中重度損傷患者幾乎都會遺留不同程度的殘疾，研究顱腦損傷患者繼發性腦損傷的機制、對顱腦損傷患者進行神經保護是近年來研究的重點。大量的研究〔4～6〕表明，外傷對腦的傷害主要是由傷后逐漸發展的繼發性腦損傷造成的。顱腦損傷后影響繼發性損傷的因素主要有氧化應激、興奮性氨基酸釋放和興奮毒性損傷、線粒體損傷、細胞內鈣離子超載、腦水腫等。

近年來研究發現，EPO可以發揮神經保護作用，EPO與其受體結合可以發揮減輕腦水腫、抑制炎癥反應等作用。本研究結果說明在顱腦外傷后，EPO與EPOR的表達均在短時間內顯著升高，但是在達到高峰后，EPO的表達開始減弱，而EPOR的表達水平仍維持在較高的水平。這可能與局部的某些細胞因子如白細胞介素-1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉化生長因子-β(TGF-β)等的表達變化及作用有關〔7〕。文獻〔8〕報道，這些炎癥因子可以抑制EPO的表達，同時刺激EPOR的表達上調。顱腦損傷后，EPO與其受體表達時間及濃度不一致，EPO的表達具有短暫性和滯后性的特點，提示在顱腦損傷治療過程中外源性給予EPO的必要性。另外，文獻〔9〕也證實外源性的EPO可以通過血腦屏障進入循環系統，進一步證實了顱腦損傷時外源性給予EPO的作用。

綜上，創傷性顱腦損傷后，EPO及其受體EPOR表達的時間和濃度不同，在EPOR大量表達時，及時給予外源性的EPO在治療中可以發揮較理想的神經保護作用，而EPO及其受體的變化以及與局部炎癥因子之間的關系尚待進一步研究。

4 參考文獻

1朱占勝,吳明燦,張家均,等.創傷性顱腦損傷后白介素-6、18、27變化及臨床意義〔J〕.廣東醫學,2011;32(6):762-3.

2Ponce LL,Navarro JC,Ahmed O,etal. Erythropoietin neuroprotection with traumatic brain injury〔J〕. Pathophysiology,2013;20(1):31-8.

3王 亮.促紅細胞生成素與內皮祖細胞在腦損傷中的應用前景〔J〕.國際神經病學神經外科學雜志,2010,37(5):439-42.

4Brines ML,Ghezzi P,Keenan S,etal. Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA,2000;97(19):10526-31.

5Maiese K,Chong ZZ,Hou J,etal. Erythropoietin and oxidative stress〔J〕.Curr Neurovasc Res,2008;5(2):125-42.

6Negre O,Fusil F,Henri A,etal. Activation and inhibition of the erythropoietin receptor by a membrane-anchored erythropoietin〔J〕. Exp Hematol,2008;36(4):412-23.

7李 喆,覃 曉,張江鋒,等.大鼠肢體缺血再灌注后不同時相血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平變化及意義〔J〕.廣西醫學,2012;34(2):172-4.

8Liao ZB,Jiang GY,Tang ZH,etal. Erythropoietin can promote survival of cerebral cells by downregulating Bax gene after traumatic brain injury in rats〔J〕. Neurol India,2009;57(6):722-8.

9Meng Y,Xiong Y,Mahmood A,etal. Dose-dependent neurorestorative effects of delayed treatment of traumatic brain injury with recombinant human erythropoietin in rats〔J〕. J Neurosurg,2011;115(3):550-60.