預防性綠茶多酚干預對帕金森病小鼠多巴胺能神經元的保護作用

葉 俊 陳 敏 黃雪芳 劉承偉

(桂林醫學院附屬醫院急診科，廣西 桂林 541004)

帕金森病(PD)是中老年人常見的中樞神經系統變性疾病，其發病機制至今尚未闡明，在早期如何通過一系列的干預手段預防或延緩PD的發生發展則具有重大意義。目前傾向于認為氧化應激水平的提高是PD重要的病理生理機制之一〔1～3〕。在氧化應激時，與幼年動物相比，老年動物對蛋白質的損傷更敏感，并且動物暴氧化應激狀態時所導致的酶學改變與衰老時變化相似。綠茶多酚(GTPs)是一種抗氧化劑,是綠茶中所提取的多酚類化合物，含豐富的兒茶素，其中以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)含量最多，占兒茶素含量的50%～60%，被認為是GTPs的主要活性物質，具有抗氧化、清除自由基的積極作用〔4，5〕，在許多神經變性疾病中顯示出神經保護作用。本研究以神經毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)注射C57BL/6J老年小鼠建立PD模型，研究預防性GTPs干預是否存在對PD老年模型多巴胺能神經元存在更好的保護和修復作用并進一步探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性C57BL/6J小鼠，SPF級，18月齡60只，體重20～25 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證編號：SCXK(京)2009-0004；飼養條件：桂林醫學院SPF級實驗動物飼養室，許可證號：SYXK桂2007-0001。飼以實驗動物中心提供的飼料(成分為大米粉、玉米粉、魚粉等)。自由攝食、飲水，適應環境1 w后進行實驗。實驗室溫度25℃～28℃，通風、自然采光。

1.2主要試劑 GTPs，由浙江東方茶業科技有限公司提供， 生產批號為20070518， GTPs純度100%，其中EGCG 含量為70.75%。MPTP購自Sigma公司。兔抗酪氨酸羥化酶抗體(TH)由Bioworld 公司提供，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成公司。其他試劑均為國產或進口分析純。

1.3動物分組及處理 隨機分成預防組、MPTP組、治療組和空白對照組，各組均為15只。MPTP處理方式為腹腔注射MPTP(30 mg/kg)，1次/d，連續7 d；GTPs干預方式為在小鼠飲水中摻入GTPs，濃度為0.1%(W/V)。

模型組：每日上午MPTP處理。預防組：注射MPTP前3個月開始GTPs干預MPTP處理。治療組：MPTP處理后開始GTPs干預3個月。空白對照組：腹腔注射同體積的生理鹽水，連續7 d。

1.4黑質多巴胺能神經元數目測定 各組動物各取7只進行免疫組織化學方法測定黑質多巴胺能神經元數目。麻醉動物后以4%多聚甲醛經心灌注斷頭取腦后固定，常規脫水，石蠟包埋，連續冠狀切片(片厚4 μm)，隔三取一，后行TH染色：二甲苯梯度脫蠟，無水乙醇，95%乙醇，蒸餾水進行水化處理，0.01 mol/L PBS洗3次；切片甩干，用免疫組化專用油筆在腦切片周圍畫圈；3%過氧化氫室溫孵育30 min；0.01 mol/L PBS洗3次；加封閉液室溫20 min；加TH(1∶200)4℃過夜； 0.01 mol/L PBS洗3次；加二抗(1∶200)室溫，2 h孵育；0.01 mol/L PBS洗3次；加鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶(1∶100)，室溫1 h。DAB液顯色3～10 min；PBS終止反應；蘇木素復染5 min；梯度酒精脫水，中性樹脂封片。

1.5SOD和MDA水平測定 各組動物各取8只進行SOD和MDA水平測定。小鼠迅速斷頭取腦,冰上分離中腦腹側組織，吸干稱重后置于勻漿器內充分勻漿，低溫 14 000 r/min離心30 min，參照試劑盒說明書分別測定氧化應激標志物SOD和脂質過氧化物MDA水平。

2 結 果

2.1黑質多巴胺能神經元計數結果 TH陽性神經元胞體聚集于黑質致密區(SNc)，突起密集分布于黑質網質區(SNr)。與空白對照組TH陽性細胞數量(235±22.5)比較，預防組(201±20.5)、治療組(185±21.9)、MPTP組(150±23.2)均明顯降低(P<0.01)，但預防組降低幅度最小。見圖1。

圖1 小鼠腦組織黑質TH疫組織化學染色(×100)

2.2SOD和MDA水平測定 MPTP組、預防組和治療組SOD水平均較空白對照組降低(P<0.01)，而MDA水平則相反(P<0.01)，變化幅度預防組<治療組

表1 各組SOD和MDA測定結果

3 討 論

PD是與衰老密切相關的神經系統退行性疾病，平均發病年齡為60周歲，故而本實驗選擇老年動物建立模型，力求最大限度接近PD真實的發病背景。衰老與氧化應激反應之間的密切關系已被許多實驗所研究并證實。衰老是由于自由基進攻細胞，過度氧化所致。隨著年齡增長自由基清除劑活性下降，大量有害自由基會破壞組織細胞，組織器官的機能逐步發生紊亂及障礙，過多的活性氧自由基就會有破壞行為，導致人體正常細胞和組織的損壞，心臟病、老年癡呆癥、PD和腫瘤等疾病就會接踵而來。 以MPTP成功誘導C57BL/6J老年小鼠建立經典的亞急性PD模型后用GTPs進行干預,發現GTPs能夠有效減少MPTP造成的黑質多巴胺神經元的丟失、降低SOD及提高MDA水平和活性，增加抗氧化能力，尤其是在損傷前使用GTPs干預的預防組各項指標均優于GTPs后處理的治療組。

PD特征性病理變化為黑質多巴胺能神經元的大量變性缺失，當達到60%～80%水平時就會出現靜止性震顫、肌強直、運動遲緩等典型癥狀。本實驗應用GTPs干預后證實GTPs能夠減少多巴胺能神經元的缺失起到保護作用，而在損傷前進行預防性用藥則能達到更佳效果。PD發病機制至今不甚明了，但是隨年齡增長同時升高的氧化應激水平已為大多數學者所關注和認同的研究熱點〔6〕。抗氧化是預防衰老的重要步驟，因為自由基或氧化劑會將稀薄的組織分解，影響代謝功能，并會引起不同的健康問題。

SOD和MDA等抗氧化指標的測定是研究氧化應激水平的常用手段。EGCG是GTPs的重要活性成分，主要以原型存在于血液和靶器官中，且能夠通過血腦屏障(BBB)進入神經系統〔7〕，成為其發揮神經保護作用的前提。預防性使用GTPs，將整體內環境包括神經系統在內的抗氧化能力和清除自由基的功能〔8〕在病變之前先提升到更高水平或減少由衰老所致過多的氧自由基，降低體內自由基水平，同時促進內源性抗氧化酶如SOD的生成，從而提高發生病理改變的閾值，在同等的致病條件下能降低被損傷程度和范圍，最大限度的保護包括黑質多巴胺能神經元在內的神經系統，其效果遠遠大于病變之后的治療性用藥的神經修復作用。外源性補充GPTs，通過抗氧化、抗炎等廣泛的生物活性途徑對多巴胺能神經元進行保護和修復，作為防治PD及其他神經系統退行性疾病可能的安全的潛在性途徑，具有良好的研究價值和應用前景。

4 參考文獻

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4Guo Q，Zhao B，Li M,etal.Studies on protective mechanisms of four components of green tea polyphenols against lipid peroxidation in synaptosomes〔J〕.Biochim Biophys Acta，1996；1304(3):210-22.

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