乳腺小黏蛋白基因在檢測乳腺癌病人外周血微轉(zhuǎn)移中的應用價值

劉平賢

(南陽市中心醫(yī)院乳腺分泌腺外科，河南 南陽 473000)

我國乳腺癌的發(fā)病率約占婦女腫瘤三分之一, 而且具有較高的死亡率〔1〕。遠處轉(zhuǎn)移是造成乳腺癌病人死亡的主要原因。乳腺癌的轉(zhuǎn)移模式并非固定不變的,早期乳腺癌亦有隱匿性轉(zhuǎn)移〔2〕。故早期檢測外周血微轉(zhuǎn)移對該病的有效治療及評判預后意義重大。本文以乳腺小黏蛋白(SBEM)基因作為檢測指標, 分析乳腺癌病人外周血中的循環(huán)腫瘤細胞及其在微轉(zhuǎn)移檢測中的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 本院2011年2月至2012年11月111例乳腺癌病人外周血標本。年齡30～79歲, 平均(46.4±16.5)歲。根據(jù)乳腺癌組織學類型劃分: 99例浸潤性導管癌, 7例浸潤性小葉癌, 4例黏液癌, 1例單純癌。TNM分期情況: 21例Ⅰ期, 75例Ⅱ期, 15例Ⅲ期。孕激素受體(PR)陽性及陰性分別為46例與65例; 雌激素受體(ER)陽性及陰性分別為69例與42例。此外，對照組選擇18例女性結(jié)/直腸癌、24例女性胃癌、42例女性乳腺纖維腺瘤病人以及29例女性健康志愿者的外周血標本。全部病人均通過臨床病理學確診, 乳腺癌病人術(shù)前胸片X線檢查、CT、B超以及骨掃描等未見轉(zhuǎn)移灶。

1.2儀器與耗材 聚合酶鏈反應(PCR)儀為美國PE公司生產(chǎn); 凝膠成像儀為美國Bio-Rad公司生產(chǎn); 分光光度計為上海第二分析儀器公司生產(chǎn); 淋巴細胞分離液購自天津TBD公司; 核酸提取及逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR試劑盒均購自Promega公司; Taq DNA聚合酶購自MBI公司; 核酸染料EB購自華美公司; DNA 分子量標記購自Sangon公司。

1.3引物設計 應用Primer5.0軟件設計引物, 合成工作委托上海生工完成。SBEM mRNA首輪PCR左引物序列: 5′-TAGCAGTCCTGGTACTCTTGG-3′; 右引物序列: 5′-AGCTGATTCCATCTCAGGGAC-3′, PCR產(chǎn)物長度為276 bp; 第二輪PCR左引物序列: 5′-TGCCCAGAATCCGACAACA-3′; 右引物序列: 5′-GCAGTGGTCGCAGTGGTTG-3′, PCR產(chǎn)物長度為114 bp。

1.4收集標本及核酸提取 全部病人采血前均未實施輔助治療。采5 ml外周血, 通過EDTA抗凝處理, 淋巴細胞分離液獲得單個核細胞。根據(jù)試劑盒步驟在0.5 h內(nèi)抽提組織總RNA。分光光度計檢測RNA的純度, 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否降解。

1.5RT-PCR擴增 根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書步驟實施基因擴增。RT-PCR總反應體系為20 μl, 包括AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.7 μl, mRNA模板2 μl, MgCl2(25 mmol/L)4 μl, dNTPs 2 μl, 10×緩沖液 2 μl, 核酸酶抑制劑0.5 μl, Oligo(dT) 151 μl, 去核酶水7.8 μl。在42℃條件下逆轉(zhuǎn)錄15 min; 逆轉(zhuǎn)錄酶在95℃下熱變性5 min。首輪PCR總反應體系為25 μl, 包括cDNA 1 μl, 10×緩沖液 2.5 μl, MgCl2(25 mmol/L) 2 μl, DNA聚合酶0. 2 μl, dNTPs 0.5 μl, 左、右引物各為1 μl, 去核酶水16.8 μl。循環(huán)條件為預變性94℃, 4 min; 共32次循環(huán)擴增, 94℃, 45 s變性; 54℃, 45 s退火; 72℃, 60 s延伸, 最后延伸72℃ 5 min。第二輪PCR取首輪PCR產(chǎn)物1 μl作為擴增模板, 加第二輪PCR左、右引物各1 μl。擴增條件為94℃預變性 5 min; 共32次循環(huán)擴增, 94℃, 45 s變性; 57℃, 45 s退火; 72℃, 60 s延伸, 最終72℃延伸10 min。使用100 bp DNA 梯度作為分子量標記, 在濃度為2%的瓊脂糖凝膠中電泳,在紫外光下觀察并記錄結(jié)果。

1.6統(tǒng)計學分析 應用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1測序結(jié)果 所擴增的SBEM基因片段序列提交GeneBank數(shù)據(jù)庫并通過BLAST程序，進行同源性比對后證實所得產(chǎn)物即為SBEM基因的部分序列。

2.2外周血中SBEM基因的表達情況 乳腺癌組外周血陽性表達率〔53.15%(59例)〕與乳腺纖維腺瘤組(0)、健康組(0)、胃癌組(0)和結(jié)直腸癌組(0)相比差異顯著(P<0.05)。見圖1。

2.3SBEM基因陽性表達與乳腺癌病理學特征的相關(guān)性 SBEM基因的陽性表達與病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期之間具有相關(guān)性(P<0.01); 而與病人年齡大小、病理類型、原發(fā)腫瘤體積、ER以及PR等無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 SBEM基因在乳腺癌外周血的陽性表達及病理學特征的相關(guān)性〔n(%)〕

3 討 論

目前我國乳腺癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居首位〔3〕。文獻報道稱乳腺癌發(fā)病早期即存在微轉(zhuǎn)移〔4，5〕。血液循環(huán)系統(tǒng)中的癌細胞是造成腫瘤轉(zhuǎn)移及復發(fā)的主要誘因, 故而盡早查出外周血中的腫瘤細胞不但對防范復發(fā)及轉(zhuǎn)移有重大潛在價值, 而且對腫瘤病人的臨床治療意義重大。

關(guān)于乳腺癌微轉(zhuǎn)移檢測, 尚無靈敏度高的分子標記。故選用特異性高的指標基因是確保微轉(zhuǎn)移檢測結(jié)果可靠性的關(guān)鍵所在〔6〕。SBEM的基因定位在染色體12q上, 它由3條8個氨基酸的短肽前后重復的疏水核心構(gòu)成, 與唾液黏蛋白結(jié)構(gòu)相似。SBEM基因的表達呈現(xiàn)出明顯的特異性, 僅表達于乳腺及唾液腺中, 具有高度的特異性, 特別適用于檢測乳腺癌微轉(zhuǎn)移, 提倡作為早期診斷乳腺癌的分子標記。

RT-PCR具有較高的敏感度, 可在1×106～1×107個正常細胞中分辨出一個腫瘤細胞〔7〕。在外周血中腫瘤細胞檢測方面, RT-PCR能夠擴增出腫瘤細胞中標志性的靶基因來說明外周血中存在腫瘤細胞, 已被普遍應用于檢測各種實體瘤微轉(zhuǎn)移〔8〕。本研究因存在大量RNA酶, 血漿中無游離的mRNA, 故經(jīng)RT-PCR方法檢測出的SBEM mRNA必然源于外周血中完整的循環(huán)細胞, 而且正常乳腺細胞以及乳腺良性腫瘤細胞是不能進入外周循環(huán)的, 而乳腺癌細胞外則可以進入外周循環(huán), 故SBEM mRNA陽性則提示血液循環(huán)中存在乳腺癌細胞〔9〕。

本研究說明SBEM基因在檢測乳腺癌外周血循環(huán)腫瘤細胞方面的特異性較高。SBEM基因表達的陽性率隨TNM分期呈正相關(guān)。這與惡性腫瘤細胞的生物學行為相一致。此外，本研究表明Ⅰ及Ⅱ期乳腺癌病人可能存在血循環(huán)微轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。不是全部乳腺癌病人外周血中均可檢測出SBEM mRNA表達。這表明腫瘤細胞是成簇且不連續(xù)地進入血液循環(huán)中的, 故增加取血次數(shù)及一次取血量將增大陽性率。腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)是乳腺癌預后的重要指標。

總之，外周血中SBEM mRNA表達的陽性率在某種程度上可以反映出臨床病期, 對指導臨床治療以及評判預后具有重要價值，但仍需對病人進行長期隨訪, 以明確微轉(zhuǎn)移與復發(fā)、轉(zhuǎn)移以及預后之間的相關(guān)性。

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