黃芪對糖尿病大鼠胰島素信號傳導的影響

魏 倩 武月婷 侯雨菲 高 影

(吉林大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學教研室，吉林 長春 130021)

胰島素抵抗在糖尿病(DM)的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，在Ⅰ型、Ⅱ型DM中均存在〔1，2〕，因此單純通過注射胰島素治療DM并不能最大程度改善機體的代謝情況。氧化應激可以導致酪氨酸磷酸酶類的失活〔3〕，使胰島素信號傳導通路出現(xiàn)異常，從而產生胰島素抵抗〔4〕。因此，改善機體的氧化應激狀態(tài)，可以在一定程度上改善機體的胰島素抵抗。天然藥物黃芪具有很好的抗氧化作用〔5，6〕。本研究擬探討黃芪通過改善機體氧化應激狀態(tài)從而改善胰島素信號傳導的相關機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 成年Wistar雄性大鼠，質量為(200±10)g，購于北京華阜康生物科技有限公司。鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)；黃芪注射液由黑龍江珍寶島制藥公司生產；魚精蛋白鋅胰島素注射液由江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司生產(批號：國藥準字H10890001)，4℃保存。糖基化終末產物(AGEs)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司。抗磷酸化c-jun氨基末端激酶(JNK)抗體購于美國CST公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)由中國碧云天生物技術研究所提供。抗磷酸化胰島素受體底物(IRS)-1 Ser307和抗p-IRS-1 Tyr612抗體購于美國圣克魯斯生物技術公司。抗IRS-1、抗肌動蛋白(β-actin)、二抗山羊抗兔和二抗兔抗山羊抗體購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.2模型復制、分組及給藥方法 Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)1 w后，禁食12 h，給予60 mg/kg STZ藥量腹腔注射。STZ溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，溶劑為0.1 mol/L，pH=4.5的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。2 d后尾靜脈采血測空腹血糖(FBG)值，以FBG≥16.7 mmol/L作為DM模型成功標準，不成功則隔日給予STZ 40 mg/kg進行二次注射。若1，3和5 d大鼠FBG值均≥16.7 mmol/L，則DM模型造模成功。將DM模型大鼠隨機分為模型組(DM組)、黃芪組(RA組)、胰島素組(Ins組)和黃芪加胰島素組(RA+Ins組)，每組6只。另取6只大鼠，腹腔注射等劑量溶劑，作為對照組。每天10點，給予DM組和對照組生理鹽水灌胃，RA和RA+Ins組黃芪注射液5 mg/ml灌胃，RA+Ins和Ins組2 U胰島素大腿外側皮下注射的處理。每3 d檢測FBG，根據血糖情況調整胰島素劑量，使FBG水平在4～8 mmol/L。持續(xù)給藥8 w。自由飲食飲水。

1.3樣本采集及指標檢測 給藥8 w后，禁食，稱量大鼠體重。使用10%水合氯醛麻醉后，腹主動脈取血，靜置30 min，1 500 r/min離心10 min，收集血清，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｕ〈笫竽I臟和骨骼肌稱重后，液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1大鼠腎臟、視網膜AGEs含量的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法，操作過程嚴格按照試劑盒的說明書。

1.3.2Western印跡檢測大鼠骨骼肌中p-SAPK/JNK、p-IRS-1 Ser307和p-IRS-1 Tyr612的表達 稱量大鼠骨骼肌組織 40 mg，加入400 μl RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)，充分勻漿，4℃靜置30 min，每5 min 震蕩1次。4℃ 14 000 r/min離心5 min，取上清。BCA法蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量，操作過程嚴格按照說明書進行，樣本定量為5 mg/ml。配制分離膠和濃縮膠；在加樣孔中加入30 μg樣品，接通電源，80 V電泳；調電流至100 mA，轉膜120 min；取出PVDF膜，放入裝有10 ml封閉液平皿內，室溫輕搖3 h；一抗過夜；TBST室溫洗膜10 min×3次；二抗1 h；用TBST洗膜10 min×3次；等體積適量ECL A和B液，直接在保鮮膜上混合；將膜取出，用濾紙略吸TBST，置于保鮮膜上；涂勻，用保鮮膜包裹，濾紙吸去多余ECL；將膜固定于暗盒內，壓片曝光；顯影定影；用Quantity one軟件對條帶進行分析。

1.4統(tǒng)計學分析 使用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析和SNK檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠腎臟和視網膜AGEs比較 與對照組比較，其他組大鼠腎臟和視網膜AGEs水平均較高(P<0.05)。與RA和Ins組比較，RA+Ins組腎臟和視網膜AGEs水平顯著較低(P<0.05)，DM組腎臟和視網膜AGEs水平顯著較高(P<0.05)。RA組與Ins組大鼠腎臟和視網膜AGEs水平差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腎臟和視網膜AGEs水平的比較

2.2各組大鼠骨骼肌組織中p-SAPK/JNK的表達 表2和圖1可見，與對照組相比，其他組大鼠骨骼肌中p-SAPK/JNK Thr183的表達水平顯著較高(P<0.05)。與DM組比較，RA、Ins和RA+Ins組表達水平顯著較低(P<0.05)，其中RA+Ins組最低，Ins組次之。各組大鼠骨骼肌中p-SAPK/JNK Tyr185的表達情況與p-SAPK/JNK Thr183相同。

表2 各組大鼠骨骼肌組織中p-SAPK/JNK表達的比較

圖1 Western印跡檢測p-SAPK/JNK及p-IRS-1蛋白表達

2.3各組大鼠骨骼肌組織中p-IRS-1 Ser307和p-IRS-1 Tyr612的表達 與對照組相比，組大鼠骨骼肌中p-IRS-1 Ser307的表達水平顯著較高(P<0.05)。與RA+Ins組比較，DM、RA和Ins組表達水平顯著較高(P<0.05)，DM組最高，RA組次之。與DM組比較，RA、Ins和RA+Ins組大鼠骨骼肌p-IRS-1 Tyr612的表達水平顯著較高(P<0.05)；與RA+Ins組比較，RA和Ins組顯著較低(P<0.05)，對照組顯著較高(P<0.05)。見表3和圖1。

表3 各組大鼠骨骼肌組織中p-IRS-1 Ser307和p-IRS-1 Tyr612表達的比較

3 討 論

流行病學資料表明在世界范圍內，DM的患病人數已經將近3億，預計到2050年患病人數將達到3.5億〔7〕。目前，注射胰島素是最為有效的治療方法，但是單純胰島素療法存在很多問題，如胰島素注射間隔期血糖波動難以控制，胰島素注射時可能產生的低血糖問題〔8〕等。這些問題甚至比DM本身更損傷機體。本研究結果提示黃芪可以改善DM大鼠機體內氧化應激狀態(tài)，降低氧化應激產物水平，緩解胰島素抵抗效應，黃芪與胰島素聯(lián)合使用效果最佳。

氧化應激是造成胰島素抵抗和DM的重要因素，胰腺本身抗氧化能力弱，大量的活性氧簇(ROS)能夠直接損傷胰島β細胞〔9〕。機體的高糖狀態(tài)可以進一步加劇氧化應激，從而產生惡性循環(huán)。AGEs在DM慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，是由持續(xù)高血糖引起體內多種蛋白質非酶糖基化產生，可以加劇機體的氧化應激，主要存在于腎臟及視網膜中。本研究結果提示黃芪和胰島素均可以降低DM大鼠AGEs的水平，改善機體氧化應激狀態(tài)。

JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族中重要的一員，JNK的激活與炎癥信號通路和氧化應激密切相關。目前已經公認JNK可以使IRS-1第307位的絲氨酸磷酸化導致胰島素抵抗〔10〕。IRS-1在胰島素信號傳導過程中起主要作用，在DM患者的骨骼肌中注入胰島素后IRS-1絡氨酸磷酸化程度明顯低于正常人〔11〕。IRS-1 Ser307磷酸化在介導胰島素負反饋調節(jié)方面起重要作用，它不僅可以干擾IRS-1與其受體的結合而且減少IRS-1酪氨酸的磷酸化，從而使胰島素信號傳導異常〔12～14〕。本研究顯示，黃芪可以降低p-SAPK/JNK的表達，從而降低IRS-1 絲氨酸磷酸化程度，使酪氨酸磷酸化程度升高，保證胰島素信號的傳導，改善胰島素抵抗效應。

4 參考文獻

1Alberti KG，Zimmet P.Epidemiology：global burden of disease—where does diabetes mellitus fit in〔J〕?Nat Rev Endocrinol，2013；9(5)：258-60.

2Liu HY，Cao SY，Hong T，etal.Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM)〔J〕.J Biol Chem，2009；284(40)：27090-100.

3Boura-Halfon S，Zick Y.Phosphorylation of IRS proteins，insulin action，and insulin resistance〔J〕.Am J Physiol-Endocrinol Metab，2009；296(4)：E581-91.

4Concei??o EPS，F(xiàn)ranco JG，Oliveira E，etal.Oxidative stress programming in a rat model of postnatal early overnutrition—role of insulin resistance〔J〕.J Nutrit Biochem，2013；24(1)：81-7.

5Huang WM，Liang YQ，Tang LJ，etal.Antioxidant and anti-inflammatory effects of Astragalus polysaccharide on EA.hy926 cells〔J〕.Exp Therap Med，2013；6(1)：199-203.

6Yu KZ，Liu J，Guo BL，etal.Microscopic research on a multi-source traditional Chinese medicine，Astragali Radix〔J〕.J Natural Med，2014;68(2):340-50.

7Olshansky SJ.Projecting the future of US health and longevity〔J〕.Health Aff(Millwood)，2005；24：(S2):W5R86-9.

8Grunberger G.The need for better insulin therapy〔J〕.Diab Obes Metab，2013；15(s1)：1-5.

9Dave GS，Kalia K.Hyperglycemia induced oxidative stress in type-1 and type-2 diabetic patients with and without nephropathy〔J〕.Cell Molec Biol(Noisy-le-Grand，F(xiàn)rance)，2006；53(5)：68-78.

10Kaneto H，Xu G，F(xiàn)ujii N，etal.Involvement of c-Jun N-terminal kinase in oxidative stress-mediated suppression of insulin gene expression〔J〕.J Biol Chem，2002；277(33)：30010-8.

11Bj?rnholm M，Kawano Y，Lehtihet M，etal.Insulin receptor substrate-1 phosphorylation and phosphatidylinositol 3-kinase activity in skeletal muscle from NIDDM subjects after in vivo insulin stimulation〔J〕.Diabetes，1997；46(3)：524-7.

12Aguirre V，Werner ED，Giraud J，etal.Phosphorylation of Ser307 in insulin receptor substrate-1 blocks interactions with the insulin receptor and inhibits insulin action〔J〕.J Biolog Chem，2002；277(2)：1531-7.

13Egawa T，Tsuda S，Ma X，etal.Caffeine modulates phosphorylation of insulin receptor substrate-1 and impairs insulin signal transduction in rat skeletal muscle〔J〕.J Appl Physiol，2011；111(6)：1629-36.

14Herschkovitz A，Liu YF，Ilan E，etal.Common inhibitory serine sites phosphorylated by IRS-1 kinases，triggered by insulin and inducers of insulin resistance〔J〕.J Biol Chem，2007；282(25)：18018-27.