姜黃素對大鼠全腦缺血/再灌注后的保護機制

李天平 陳俞先 徐 珽

(四川大學華西藥學院，四川 成都 610041)

目前腦缺血尚無有效的治療方法。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導的興奮毒性是缺血性腦損傷發生的關鍵機制之一〔1〕。NR1作為NMDA結構受體，在海馬組織的選擇性表達是海馬容易發生缺血性損傷的原因之一〔2〕。腦源性神經營養因子(BDNF)在保護局部性腦缺血所誘發的細胞壞死凋亡過程中起重要作用。BDNF能夠提高神經元的存活率和突觸的可塑性，抑制短暫性腦缺血引發的細胞損傷，可以避免局部性腦缺血所產生的海馬CA1區的神經細胞壞死凋亡。姜黃素因其具有抗炎、抗氧化的作用〔3〕，在神經系統疾病治療研究中有重要的地位。有研究〔4〕顯示姜黃素能減輕腦缺血/再灌注(I/R)后神經細胞凋亡,但這是否與減輕興奮性神經毒有關目前尚不清楚。本實驗考察腦組織海馬神經細胞形態學變化及BDNF、NR1 mRNA及蛋白表達變化，從而進一步探索姜黃素抗缺血性腦損傷的機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 NR1抗體(Sigma公司)、BDNF抗體(Sigma公司)兔抗鼠二抗(Chemicon公司)、RT-PCR試劑盒(日本Takara)和實時定量PCR試劑盒(日本Takara);姜黃素(美國Sigma公司)。

1.2動物模型 18只清潔級沙鼠 10～12周齡，體重275～350 g,由實驗動物中心提供。動物隨機分成三組:假手術組(SH)、I/R組、治療組(姜黃素100 mg/kg)。治療組在缺血后給予動物100 mg/kg姜黃素腹腔注射，每5 h注射1次。在再灌注3 d后對各組提取樣本。

1.3模型制備 參照Pulsinelli的方法并改進，構建頸動脈雙側血管阻斷全腦I/R的沙鼠模型。沙鼠經水合氯醛麻醉后,分離雙側頸總動脈，用無創動脈夾夾閉雙側頸總動脈10 min，重新恢復血流，縫合皮膚。治療組腹腔注射溶于二甲基亞礬(DMSO)的姜黃素100 mg/kg。控制室溫在36℃～37℃。使用神經功能評分判定全腦I/R造模成功。

1.4神經功能評分 再灌注3 d后，對各組沙鼠進行Garcia神經功能評分。功能正常時得分最高為18 分，功能損傷越嚴重越低。

1.5RT-PCR法測定BDNF、NR1 mRNA含量 提取海馬總mRNA，參照試劑盒說明書進行實時定量RT-PCR含量標準曲線法進行定量，檢測海馬NR1 mRNA和BDNF mRNA含量引物序列，見表1。

1.6Western印跡法測定BDNF和NR1的蛋白表達 沙鼠水合氯醛麻醉，迅速斷頭剝取海馬，加入500 μl RIPA裂解液，超聲勻漿后低溫高速離心，取上清液。BCA法測蛋白濃度，上樣，電泳，一抗(抗NR1，1∶400稀釋； 抗-BDNF，1∶200稀釋；β-actin，1∶5 000稀釋)孵育，二抗1∶5 000稀釋，化學發光法(ECL)顯影。實驗結果用Quantity One軟件分析。

2 結 果

2.1神經功能評分 沙鼠在再灌注后開始表現一定程度的行為學紊亂，3 d后，對各組沙鼠進行其Garcia神經功能評分。姜黃素治療后，沙鼠評分由8.23±0.59上升到13.32±0.72(P<0.01,n=6)，有顯著療效，SH組為16.5±0.212沙鼠的行為有一定程度的恢復。

2.2海馬組織NR1、BDNF mRNA表達 I/R組海馬中BDNF mRNA(0.72±0.13)比SH組(0.52±0.04)升高(P<0.05)，而給予100 mg/kg的姜黃素后會使BDNF mRNA增加到0.96±0.07(P<0.01)。I/R組 NR1 mRNA(0.89±0.05)與SH組(1.56±0.02)相比降低(P<0.05)，而治療組的表達則是上升到了1.29±0.05(P<0.01)。

2.3海馬組織NR1和BDNF的蛋白表達 姜黃素使沙鼠腦I/R后海馬組織中的BDNF和NR1的蛋白表達上調；I/R組海馬CA1區BDNF上調、NR1蛋白下降(P<0.01)。見表2，圖1。

表1 實時定量RT-PCR檢測BDNF mRNA和NR1 mRNA表達的引物序列

表2 NR1、 BDNF蛋白在各組腦海馬組織中的濃度比值

圖1 姜黃素對沙鼠海馬BDNF 和 NR1的蛋白含量的影響

3 討 論

本實驗研究結果顯示：用姜黃素預處理的沙鼠可以顯著保護海馬的神經元細胞，并能對沙鼠行為模式產生影響。姜黃素對BDNF和NR1有明顯的調節作用。海馬神經元的形態學變化和壞死是腦缺血后神經細胞死亡的主要形式〔6〕。

NMDA的受體蛋白是由必須的結構亞型NMDAR1和調節亞型NMDAR2兩種亞單位構成的異聚體〔4〕。NR2蛋白與N1蛋白結合后對其功能及特性起輔助修飾作用，而不能獨立的發揮作用。因此,本實驗選擇腦缺血后NR1蛋白表達的變化來反映NMDAR蛋白在腦I/R后的變化。缺血后胞質內Ca2+含量的增加是啟動細胞變性凋亡的關鍵因素,而鈣超載主要由NMDA受體介導〔6〕。BDNF作為腦神經營養因子，在神經系統疾病中的保護作用不可忽視，研究〔4〕顯示 BDNF可能會在再灌注后保護性的增加以減少神經元的損傷。有研究表明,姜黃素預先給藥可減少全腦I/R后腦海馬組織的神經細胞凋亡〔7〕。

I/R作為一個理想的腦缺血模型，有著重要的研究意義。深入的研究顯示〔8〕，缺血后再灌注4 h后就會造成腦部損傷至3 d腦損傷的神經元細胞會達到最低谷，7 d時開始恢復。本次實驗選擇100 mg/kg姜黃素對I/R的腦損傷有保護作用，是由于姜黃素在體內代謝的特性選擇的，有研究〔9〕發現姜黃素的治療濃度存在范圍，100 mg/kg和300 mg/kg抗缺血神經細胞凋亡效果不如200 mg/kg,這可能與300 mg/kg姜黃素增加NR2B蛋白表達而啟動凋亡信號通路有關〔10〕。這也提示只有在一定劑量范圍內姜黃素才具有抗缺血性神經細胞凋亡效應。

總之,預先給予適量姜黃素能有效減少沙鼠I/R造成的海馬神經細胞變性和壞死,這可能與增強BDNF的保護機制和調節NR1的雙向調節有關; 50～500 mg/kg姜黃素可能為一個抗缺血性神經細胞變性壞死的有效藥物濃度范圍，這可能與姜黃素在體內對肝藥酶的劑量依賴性誘導有關〔11〕。

4 參考文獻

1程發峰，宋文婷，郭少英,等.三種神經功能評分在鼠類局灶性腦缺血模型評價中的比較〔J〕.中國康復醫學雜志,2011;26(4)：337-41.

2Ogawa S,Kitao Y,Hori O. Ischemia-induced neuronal cell death and stress response〔J〕.Antioxid Redox Signal,2007;9(5): 573-87.

3Maheshwari RK, Singh AK,Gaddipati J,etal. Multiple biological activities of curcumin: a short review〔J〕.Life Sci,2006;78(18): 2081-7.

4陳偉峰，周 丹，何衛平,等.大鼠急性腦缺血再灌注損傷中BDNF與NGF的變化〔J〕.海南醫學院學報,2006;12(2)：106-8.

5許東暉，王 勝，金 晶,等.姜黃素的藥理作用研究進展〔J〕.中草藥，2005;36(11)：1737-44.

6曹 紅，李 軍，李廣明，等.姜黃素對沙土鼠腦缺血/再灌注損傷的海馬CA1區細胞凋亡和即早基因c-fos、c-jun、NF-kB表達〔J〕.中國應用生理學雜志,2007;23(2):184-8.

7李江偉.紅花黃色素對家兔血漿纖溶酶原激活劑及抑制劑水平的影響〔J〕.中草藥,1999;30(2):128-9.

8張 忱，李 剛，徐婭萍,等.大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的再灌注時間窗〔J〕.中日友好醫院學報,2000;14(5): 255.

9王 旗.姜黃素的代謝研究〔J〕.中國藥理學通報,2003;19(10)：1097-101.

10梁 輝，范金英，李愛華，等.羥基紅花黃色素A對大鼠局灶性腦缺血再灌注NMDAR1蛋白表達的影響〔J〕.中華老年心腦血管病雜志,2004;6(3)：194-7.

11周 瑞，徐春紅，李 軍,等.姜黃素對缺血/再灌注大鼠海馬神經細胞凋亡及NR2A、NR2B表達的影響〔J〕.中國藥理學通報,2008;24(10)：1314-8.

12朱元貴,陳曉春,陳志哲,等.姜黃素對皮層神經元氧化損傷的保護作用〔J〕.中國藥理學通報,2004;20(10):1153-7.