芎龍膠囊對大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制

劉秀梅 張丁華 楊慶宇

(鄭州人民醫院藥學部，河南 鄭州 450000)

缺血性腦血管病發病率、死亡率、致殘率高，嚴重影響人類的健康。腦缺血再灌注損傷(CIRI)是指腦缺血致腦組織壞死前，閉塞的腦血管再通后缺血性損傷卻進一步加重的現象〔1〕。CIRI發生的機制非常復雜，主要的病理生理過程包括興奮性氨基酸毒性、鈣超載、能量代謝障礙、炎癥反應及氧自由基增多〔2～4〕。目前，中藥復方已經廣泛應用于CIRI的干預，其多途徑性與CIRI病理基礎的多樣性具有多靶點效應和協同作用。本課題組根據川芎、地龍及人參等有效成分的藥理基礎，研制了復方芎龍膠囊，觀察其對線栓法制備的大鼠CIRI模型的治療作用，同時通過對大鼠腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量，探討其保護腦組織的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、試劑和儀器 雄性Wistar大鼠120只，潔凈級，體重(200±20)g,購自鄭州大學實驗動物中心。大鼠維持飼料由鄭州大學實驗動物中心提供。膠囊由本實驗中心研制而成，主要成分有川芎、地龍和人參等名貴中藥材，按特定比例混合而成。復方丹參滴丸，天士力制藥股份有限公司。蘇木精，伊紅染液，SOD，MDA和NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所。電子天平，沈陽龍騰電子有限公司。低溫離心機，Thermo公司。切片機，德國徠卡公司。光學顯微鏡，奧林巴斯工業有限公司。

1.2動物分組、模型復制及給藥 120只大鼠隨機分為假手術(Sham)組、模型(Model)組、陽性藥復方丹參滴丸(DSDW)組、膠囊低、中、高劑量組，每組20只。各組大鼠飼養于清潔級環境中，自由飲食、飲水，維持12/12 h明暗交替，溫度(25±1)℃，濕度55%～65%。治療組以膠囊及復方丹參滴丸的羧甲基纖維素鈉懸液灌胃，0.5 ml/100 g，2次/d連續2 d，然后采用線栓法堵塞大鼠中動脈復制大鼠急性CIRI模型。10%水合氯醛0.3 ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定于鼠板并使頸部充分舒展以便手術造模，備皮并右側切開皮膚，鈍性分離游離頸總動脈，模型組經頸總動脈插入尼龍線栓至大腦中動脈閉塞，缺血2 h后將線栓抽回縫合傷口，再灌注24 h后，進行神經功能學評分。同樣方法麻醉后，行腹主動脈取血，處死大鼠，冰磷酸鹽緩沖液(PBS)灌流后，8只大鼠取腦組織凍存備用，其余12只繼續用4%多聚甲醛溶液灌流，取完整腦組織，置于10%甲醛溶液中固定待用。Sham組除不進行線栓法堵塞外，其他手術操作與模型組相同。同樣方法缺血，并固定完整腦組織樣本。Sham組與Model組用生理鹽水等體積灌胃，給藥方法與時間同前。

1.3神經功能學評分 在各組大鼠缺血2 h再灌注2 h后，按照Longa等方法，對各組大鼠進行神經功能學評分：0分，無任何神經功能缺失體征；1分，未損傷側前肢不能伸展；2分，向未損傷側弧線行走或追尾轉圈；3分，向未損傷側傾斜或傾倒；4分，意識障礙，無自主行走分。

1.4腦組織含水量的測定 各組大鼠經冰PBS灌流后，任意選取6只檢測腦組織含水量。斷頭取腦后，用濾紙吸干表面水分，分析天平稱質量，再置于烘箱中，105℃烘烤24 h至恒重，分析天平稱量干質量，計算腦組織含水量：P腦含水=(m濕腦-m干腦)/m濕腦×100%。

1.5組織切片的制備及凋亡細胞檢測 固定完全的腦組織進行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，經頂部行冠狀位連續切片，皮厚6 μm。切片依次經二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，酸水及氨水中分色，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.6腦組織SOD、MDA和NO含量的測定 實驗結束時，各組任選其中8只大鼠斷頭取腦，冰盒上分離大腦右中段皮質，稱重，用生理鹽水制備10%的組織勻漿，4 000 r/min離心，取上清，嚴格按照二喹啉甲酸(BCA)、SOD、MDA和NO試劑盒說明操作。

1.7統計學方法 計量資料組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠神經功能學評分及腦組織含水量 Sham組神經功能學評分為0；Model組大鼠與Sham組相比升高(3.42±0.27)，表明本實驗中模型建立成功；芎龍膠囊低、中、高劑量組大鼠神經功能學評分與Model組相比均有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01)，且具有一定的劑量依賴性。陽性藥組大鼠神經功能學評分降低程度與膠囊中劑量組相當。Model組大鼠腦組織在缺血2 h，再灌注24 h后含水量明顯高于Sham組(P<0.01)。芎龍膠囊低劑量組能顯著降低模型大鼠腦組織中的含水量(P<0.05)，中、高劑量組相比Model組具有極顯著意義(P<0.01)，且各組間具有劑量依賴性。陽性藥復方丹參滴丸降低模型大鼠腦組織中含水量作用與芎龍膠囊中劑量組作用相當。見表1。

表1 各組大鼠神經功能學評分及腦組織含水量

2.2各組大鼠皮質區形態學變化 Sham組可見神經元結構完整，核仁大且核膜清晰，數量豐富，神經元突起明顯；Model組神經元空泡狀壞死嚴重，且伴有嚴重的水腫；芎龍膠囊低、中、高給藥組與Model組相比神經元結構損傷減輕，數量有所恢復，且水腫程度減輕。見圖1。

2.3各組大鼠腦組織勻漿中SOD、MDA及NO含量 Model組與Sham組相比，SOD、NO含量下降，MDA含量升高，差異有統計學意義(均P<0.01)，而芎龍膠囊相對于Model組而言，SOD、NO含量顯著上調，MDA含量顯著下降，且芎龍膠囊低、中、高劑量組具有一定的劑量依賴性，復方丹參滴丸組對Model大鼠腦組織中上述三個指標調節作用與芎龍膠囊中劑量組相當。見表2。

圖1 各組大鼠皮質區形態學變化

表2 各組大鼠腦組織中SOD、MDA及NO含量

3 討 論

腦缺血后細胞的死亡主要是壞死和凋亡〔5, 6〕。壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程，主要特征是細胞迅速腫脹和崩解，表現為細胞內蛋白的變性、降解、內容物流出，進而引起周圍組織炎性反應。凋亡是細胞受到病理生理性信號刺激或者條件的變化后，自身對這種刺激產生的有序變化的死亡過程。有研究證明，CIRI過程中，凋亡在神經元的死亡過程中起著重要作用。這種低氧、低糖的信號刺激神經元細胞產生級聯反應，如ATP減少，胞漿內外離子濃度的改變，興奮性氨基酸的釋放以及氧化應激等，其中氧化應激被認為對神經元的凋亡起著關鍵作用〔7〕，此外，NO釋放的減少被認為會進一步加重神經元細胞的凋亡〔8〕。

中醫藥治療CIRI有著悠久的歷史。中藥復方多途徑、多靶點效應與CIRI病理變化的多樣性有針對性作用。現代藥理研究證實，川芎的主要成分是川芎嗪、阿魏酸等能夠通過血腦屏障，抑制血小板聚集，降低血液黏稠度，增加腦血流量；地龍富含豐富的纖溶酶原，可直接降解纖維蛋白，達到增加腦部血流供應的目的；人參則有營養神經元細胞，抗氧化損傷的作用。實驗結果可以看出，芎龍膠囊對CIRI有很好的治療效果，可以降低大鼠腦組織的水腫情況，減少神經元凋亡，提高模型大鼠的神經功能學評分。這種治療作用主要是通過增加NO含量從而增加腦組織血流供應，增加SOD、降低MDA，從而減少腦組織中氧化損傷實現的。本研究將為芎龍膠囊成為治療CIRI治療藥物提供一定的理論基礎。

4 參考文獻

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