不同濃度TGF-β對內皮細胞鋅指基因ZNF580表達的影響

韓國亮 任黨麗 趙 英 張 梅 張文成 羅玉玉

(天津醫科大學研究生學院，天津 300070)

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的首要病因〔1〕。ZNF580是本課題組以低密度脂蛋白(LDL)誘導人臍靜脈內皮細胞得到的一個新基因(GenBank注冊號：AF184939)〔2〕，其cDNA編碼由172個氨基酸組成的蛋白質，屬于C2H2型鋅指轉錄因子家族的新成員。課題組在前期的研究工作中利用酵母雙雜交技術篩選人胎腦cDNA文庫獲得了可能與ZNF580存在相互作用的多種蛋白，并進一步證實在真核細胞中Smad2與ZNF580之間存在相互作用。Smad2是轉化生長因子β(TGF-β)信號轉導通路的關鍵分子，此通路的活化參與調節內皮細胞的增殖、凋亡、分化及血管重構與細胞外基質形成等，可能與AS的發生相關〔3～5〕。本研究采用不同濃度TGF-β刺激血管內皮細胞EA.hy926，并檢測ZNF580基因表達的改變，進一步闡明ZNF580與TGF-β信號通路間可能存在的關系。

1 材料與方法

1.1材料 人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926由協和醫科大學提供，TRIZOL試劑、TGF-β、RT-PCR試劑盒購自鼎國生物技術公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人臍靜脈內皮細胞EA.hy926用含10%小牛血清的高糖DMEM培養基于37℃，5%CO2孵箱培養，2～3 d換液1次。

1.2.2ZNF580、GAPDH引物合成 根據GenBank 發表的ZNF580 cDNA序列設計相應的引物。ZNF580引物:5’- AAA AAG ATC TTG CCC GGA GTG CGC CCG TG-3’，3’- AAA AAG CTT GTG GAG GCG CAC GTG CTG -5’，擴增產物長度為273 bp；GAPDH引物:5’-TGA AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG GT-3’，3’-CAT GTG GGC CAT GAG GTC CAC CAC-5’，擴增產物長度為982 bp。

1.2.3不同濃度TGF-β刺激內皮細胞 取對數生長期EA.hy926細胞接種于6孔板，無血清培養基饑餓12 h后，向每個孔中加入不同濃度的TGF-β ，濃度分別為：0、0.25、0.5、1、2、4 ng/ml。12 h后收集細胞，加入Trizol充分裂解細胞，準備提取總RNA。

1.2.4總RNA提取及鑒定 按Trizol試劑盒說明書提取各組細胞總RNA。紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度。

1.2.5目的片段的RT-PCR擴增 RT反應：按逆轉錄試劑盒說明操作，每20 μl反應體系內含有4 μl 25 mmol/L MgCl2，2 μl 10×逆轉錄緩沖液，2 μl 10 mmol/L dNTP混合物，0.5 μl RNA酶抑制劑，1 U AMV逆轉錄酶，0.5 μg Oligo(dT)引物，2.0 μg RNA模板。以上試劑混合后于42 ℃反應60 min，然后于99 ℃加熱5 min，滅活酶活性，立即置冰水浴10 min。

PCR反應：用上述逆轉錄cDNA為模板擴增ZNF580。每25 μl反應體系內含14.5 μl 2×PCR 緩沖液，2 μl 25 mmol/L MgCl2，2 μl 10 mmol/L dNTP 混合物，0.5 μl(2.5 U)Taq DNA 聚合酶,1 μl 25 pmol/L 引物，5 μl逆轉錄產物。PCR反應條件：94 ℃ 3 min;30×(94 ℃ 45 s,59 ℃ 45,72 ℃ 1 min );72℃ 10 min。每批模板均同時進行GAPDH的擴增作為內參。PCR產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀照相分析。

2 結 果

2.1總RNA濃度及純度 成功提取各組細胞總RNA，經紫外分光光度計檢測，總RNA濃度及純度符合RT-PCR反應要求，可以進行RT-PCR反應。見表1。

2.2RT-PCR反應結果 當TGF-β濃度從0.25～2 ng/ml逐漸增加時，ZNF580的表達呈逐漸下降趨勢，但繼續增加TGF-β刺激濃度至4 ng/ml，ZNF580的表達則有所回升(圖1及表1)。

1～5泳道分別代表0.25、0.5、1、2、4 ng/ml TGF-β刺激組，對照組TGF-β刺激濃度為0 ng/ml

表1 總RNA的濃度、純度及內皮細胞ZNF580基因相對表達量

3 討 論

近年來，AS所致心腦血管疾病的發病率逐年上升。隨著分子生物學技術的發展，研究人員已克隆出諸多和AS相關的基因。人ZNF580基因是以致動脈粥樣硬化因素-低密度脂蛋白(LDL)誘導人臍靜脈內皮細胞，采用差異顯示逆轉錄-PCR技術分析，以差異表達的ESTs為探針，篩選人主動脈cDNA文庫，得到的一個新基因(GenBank注冊號：AF184939)〔2〕。其cDNA 748-1266位堿基序列構成一個完整的開放閱讀框架，編碼172個氨基酸組成的蛋白質。經分子生物學網站進行蛋白質結構功能分析表明：其氨基端5-88位氨基酸序列為脯氨酸富含域，羧基端94-172位氨基酸序列中含有三個串聯重復的C2H2型鋅指結構域，屬于C2H2型鋅指蛋白家族的新成員。目前認為，C2H2型鋅指蛋白的主要生物學功能是作為真核生物中普遍存在的核轉錄因子來調控基因的轉錄。其在細胞分裂與增殖、器官分化、胚胎發育、脂代謝調節等生命過程中起著十分重要的作用〔6〕。

本課題組在前期的研究工作中利用酵母雙雜交技術篩選人胎腦cDNA文庫獲得了與鋅指蛋白ZNF580可能存在相互作用的多種蛋白，Smad2為其中之一。Smad2是轉化生長因子-β(TGF-β)信號轉導通路的關鍵分子。有文獻顯示：TGF-β是一類多功能的細胞因子，具有調節細胞外基質產生和沉積的強大作用，而細胞外基質的產生和沉積伴隨著動脈粥樣硬化發生、發展的進程。故TGF-β信號通路的活化可能與動脈粥樣硬化的發生、發展密切相關〔7，8〕。研究顯示：此信號通路的活化源于TGF-β與細胞表面的TGF-βⅡ、Ⅰ型受體的結合并形成配體-受體復合物，Ⅱ型受體通過磷酸化而激活Ⅰ型受體，Ⅰ型受體再磷酸化而激活細胞質內的Smads蛋白。Smad2屬于受體激活型Smads蛋白，可與Ⅰ型受體直接作用并被磷酸化。活化的Smad2進入細胞核，通過與其他轉錄因子及調節蛋白形成穩定的蛋白-蛋白復合物而調控相應靶基因的轉錄〔9〕。

本研究應用不同濃度的TGF-β刺激內皮細胞，發現當TGF-β濃度從0.25～2 ng/ml逐漸增加時，ZNF580的表達呈逐漸下降趨勢，但繼續增加TGF-β刺激濃度至4 ng/ml，ZNF580的表達又有所回升。上述結果表明：ZNF580很可能是受TGF-β信號通路調控的核轉錄因子之一。其作用機制可能為：活化的Smad2轉導進入細胞核，與ZNF580形成共作用因子，而使ZNF580的轉錄活性改變，二者共同發揮調節相應靶基因轉錄的功能，并進而參與調節血管內皮細胞增殖、凋亡等生物學行為，并可能在AS的發生發展過程中發揮作用。

4 參考文獻

1趙 蓮，薛 爽，陳 芳.炎癥、動脈粥樣硬化和心腦血管疾病〔J〕.心血管病學進展，2005；6(2)：193-6.

2張文成，陳保生，吳 剛，等.低密度脂蛋白降調節新基因cDNA的克隆及結構分析〔J〕.中華醫學雜志，2001；81(7)：435-6.

3McCafrey TA.TGF-beta and TGF-beta receptors in atherosclerosis〔J〕.Cymhme Growth Factor Roe,2001;11:1-2.

4王 林，黃體鋼.轉化生長因子與動脈粥樣硬化斑塊的穩定性〔J〕.實用心腦肺血管病雜志，2004；12(1)：52-4.

5Oscar L,Joost OF,Natasja K.Distinctive expression of chemokines and transforming growth factor-β signaling in human arterial endothelium during atherosclerosis〔J〕.Am J Pathol,2007;171(1):326-37.

6Iuchi S.Three classes of C2H2 zinc finger proteins〔J〕.Cell Mol Life Sci,2001;58(4):625-35.

7朱楚洪，應大君，糜建紅，等.TGF-β1基因對血管內皮細胞細胞外基質表達及與基質黏附的影響〔J〕.生物醫學工程學雜志，2005；22(2)：271- 4.

8傅 華，劉小昔，楊 麗，等.TGF-β 對人血管內皮細胞整合素β3及粘著斑激酶表達的影響〔J〕.華西醫大學報，2001；32(1)：21-3.

9楊 曉，黃培堂，黃翠芬.Smads 基因功能的研究進展〔J〕.Chin J Biochem Mol Biol,2000;1(16):145-50.