Neuropilins-1和Neuropilins-2在人腦膠質瘤中的表達

王睿君 王育民 劉雁飛 高建梅 包麗薇 戴軍有

(內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010050)

人腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的腫瘤，起源于神經上皮細胞，占所有原發性腦腫瘤的50%左右〔1～4〕。Neuropilins(NRPs)參與多種生理功能，包括軸突導向、細胞遷移、組織形成、調節血管生成、神經創傷的修復〔1～3〕、信號傳導以及誘導神經元細胞的凋亡和分化〔4〕。本實驗中我們采用免疫組化方法聯合檢測Neuropilins-1(NRP-1)及Neuropilins-2(NRP-2)在腦膠質瘤中的表達情況，分析其與膠質瘤級別的關系及相關性。

1 資料與方法

1.1實驗材料 收集2008年1月至2012年1月在內蒙古醫科大學第一附屬醫院神經外科就診，臨床資料保存完整的病例，行手術切除治療，術前未行放療和化療，術后病理診斷均為神經膠質瘤，其中Ⅰ級膠質瘤4例，Ⅱ級膠質瘤25例，Ⅲ級膠質瘤20例，Ⅳ級膠質瘤20例，其中Ⅰ+Ⅱ組為低惡性組，Ⅲ+Ⅳ組為高惡性組。另取5份正常腦組織標本作為對照，標本均為同期急性顱腦損傷患者因顱內減壓而切除的腦組織，液氮凍存備用。

1.2儀器與試劑 微波爐、切片機、光學顯微鏡、顯微照相系統、微量移液器以及免疫組化所需其他材料(均由內蒙古農業大學動物教研室提供)。兔抗人NRP-1、NRP-2單克隆抗體、S-P免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.3免疫組化染色 所有標本均用10%的甲醛固定，石蠟包埋，所有切片均有專業技術人員切成厚4 μm。應用免疫組化檢測，簡述如下：①組織芯片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；雙蒸水洗5 min，PBS漂洗3 min×3；②熱修復抗原：微波熱誘導抗原修復(760 W功率微波爐3檔)20 min，室溫冷卻；PBS漂洗3 min×3；③室溫下3%H2O2抑制內源性過氧化物酶20 min；PBS洗3 min×3；④20%正常羊血清室溫孵育30 min，不洗；⑤芯片分別置于兔抗人NRP-1、NRP-2多克隆抗體中，4℃孵育過夜；⑥即用型EnVision試劑37℃孵育30 min；PB漂洗3 min×3；⑦DAB顯色20 min，蘇木素復染2 min，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照，用隨試劑附已知陽性對照片作陽性對照。

1.4結果判斷 結果判定在盲法下進行，每張芯片由兩名病理醫師分別計數。染色強度計分：0分為無色；1分為淡棕黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。陽性細胞百分率：0分為陽性細胞百分率≤5%；1分為6%～25%；2分為26%～50%；3分為51%～75%；4分為≥75%。計算得分：0～2分為陰性；3～4分為弱陽性(+)；5～6分為陽性()；7～8分為強陽性()。

1.5統計學方法 SPSS13.0 統計軟件，組間比較采用秩和檢驗，各指標之間的相關性分析采用Spearman等級相關。

2 結 果

2.1NRP-1在各級腦膠質瘤中的表示 腦膠質瘤中NRP-1表達陽性率明顯高于正常腦組織(P<0.05)，且NRP-1陽性表達率隨腫瘤分級增高而增強(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 NRP-1在各級腦膠質瘤中的表達(DAB，×200)

2.2NRP-2在各級腦膠質瘤中的表達 腦膠質瘤中NRP-2表達陽性率明顯高于正常腦組織組(P<0.05)，且NRP-2隨腫瘤分級增高，表達也明顯增強(P<0.05)。見表1，圖2。

圖2 NRP-2在各級腦膠質瘤中的表達(DAB，×200)

表1 NRP-1與NRP-2在各級膠質瘤中的陽性表達〔n(%)〕

3 討 論

NRPS是一種多功能信號傳導蛋白，在機體的發育、免疫和腫瘤的發生發展中扮演著重要的角色〔5～9〕。NRP-1或它的同族NRP-2受體，能夠促進對一些生長因子或其他介導生理學低下和病理學條件的反應。他們在一些內皮細胞、幾個正常種類的細胞和惡性腫瘤細胞中表達〔9～11〕。NRP-1和NRP-2在分擔許多結構和生物學性能上有44%的同源性〔5～9〕。研究表明〔10〕，NRP-1或NRP-2表達于多種人類腫瘤細胞系，包括前列腺癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、結腸癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌，也表達于來自于膠質母細胞瘤、神經細胞瘤、骨肉瘤、白血病和黑色素瘤的細胞系，而且NRPs與惡性腫瘤的血管、淋巴管的新生和轉移都密切相關。

本研究結果顯示，隨著膠質瘤的等級增加，NRP-1、2表達而加強。NRPS既是介導神經原導向Semaphorins家族的受體，也是血管內皮生長因子(VEGF)的受體，所以NRP-1、2表達的增高，可增加腫瘤的毛細血管密度的增加，間接的為腫瘤細胞的生長和沿血管擴散提供了有利條件。Osada等〔12〕用免疫組織化學和RT- PCR 法研究發現在人神經膠質瘤臨床病理標本中NRP-1顯著表達，并且表達強度隨神經膠質瘤惡性程度增加而增強，Adham等〔13〕揭示NRP-1的表達水平與卵巢上皮細胞癌的惡性程度有關，并且NRP-1能夠促進卵巢癌血管新生及癌細胞的浸潤和轉移。Jubb等〔10，11〕通過染色與抗體的免疫組化及原位雜交嚴格驗證分析，他們觀察到腫瘤脈管系統NRP-1〔10〕和NRP-2〔11〕在絕大多數情況下是陽性；NRP-2在乳腺癌和非小細胞肺癌的陽性率可以和NRP-1相提并論〔11〕；而NRP-2在黑色素瘤的陽性率為85%。NRP-2表達了更高的陽性率在乳腺癌中〔14〕。所以，NRPs不僅在腫瘤組織或穩定的細胞株中存在高表達，而且與其發生發展、血管生成及轉移均密切相關。

4 參考文獻

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12Osada H，Tokunaga T，Nishi M,etal.Overexpression of the neuropilin 1(NRP1) gene correlated with poor prognosis in human glioma〔J〕.Ant-icancer Res，2004；24( 2B)：547-52.

13Adham SA,Sher I,Coomber BL.Molecular blockade of VEGFR2 in human epithelial ovarian carcinoma cells〔J〕.Lab Invest,2010；90(5):709-23.

14Milpied P，Renand A，Bruneau J，etal.Neuropilin-1 is not a marker of human Foxp3+ Treg〔J〕.Eur J Immunol，2009;39：1466-71.