二甲酸精氨酸二甲胺水解酶-非對稱性二甲基精氨酸系統對老年冠心病患者血管內皮細胞的影響

潘力健 龔 輝 劉 磊 王 昕

(復旦大學附屬金山醫院心血管內科，上海 201508)

冠心病是我國老年人群中常見的疾病，嚴重影響患者生存質量，是導致老年人群死亡的重要疾病之一，近年呈上升趨勢〔1〕。研究表明〔2～4〕，血栓的形成是引起冠心病患者死亡的危險因素，而由組織因子(TF)啟動的凝血系統在血栓形成過程中起到重要的作用，而一氧化氮(NO)是血管內皮功能中最重要的介質。近年相關研究指出〔5〕，內源性NO抑制物水解酶-二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)、內源性NO合酶抑制物-非對稱性二甲基精氨酸(ADMA) 屬于內源性NO生成系統，對維持及穩定血管內皮細胞功能具有重要的作用。本文將對DDAH-ADMA系統對老年冠心病患者TF表達影響進行研究，并從血栓形成的角度分析ADMA在冠心病發病機制中的作用，為冠心病臨床診治提供新的研究思路。

1 資料及方法

1.1臨床資料 選取本院2011年12月至2013年2月收治的45例老年冠心病患者為冠心病組，納入標準：(1)患者均經冠狀動脈造影術確診；(2)年齡≥60歲；(3)在知情同意下參與研究；(4)入選病例獲得本院倫理醫學委員會審批。排除標準：全身性疾病感染、心源性休克、心腦血管、血液疾病、惡性腫瘤、肝腎功能異常等患者。男28例，女17例，年齡61～82〔平均(70.3±5.4)〕歲。根據Gensini積分對患者進行分級，其中1分：6例，2分：10例，4分： 8例，8分：11例，16分：10例。另選取40例老年健康體檢者為對照組，男22例，女18例，年齡45～80〔平均(68.5±4.8)〕歲。

1.2方法

1.2.1DDAH mRNA測定 靜脈抽取兩組靜脈血10 ml，采用RT-PCR(購于日本TAKAPA公司)測定兩組外周血內皮祖細胞中DDAH mRNA含量，設計針對人DDAH PCR的探針序列以及熒光檢測引物，選擇人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，(由美國西格瑪公司提供)作為測試的內參物，并采用Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)提取RNA，熒光定量PCR實驗嚴格按照試劑盒操作說明進行。DDAH mRNA相對表達量=目的基因/內參基因。

1.2.2免疫組化法測定ADMA 靜脈抽取兩組靜脈血10 ml，經離心處理后棄去下層混濁液，留取上清液，置于-20℃冰箱中保存待測，并采用ADMA酶聯免疫試劑盒(由上海生物儀器設備公司提供)測定兩組ADMA含量，操作過程嚴格按照試劑盒說明進行。

1.2.3NOS、TF、磷脂酰膽堿(LPC)的水平測定 采用胰蛋白酶對血漿細胞進行消化，并調整細胞濃度至2×103/ml，并按照1/1 000將無血清培養液稀釋至10 μmol/L，并將樣品置于37℃培養箱中孵化20 min，采用無血清細胞培養液對樣本洗滌3次后，采用美國貝克曼庫爾特有限公司提供型號EPICS流式細胞儀測定細胞中NO合酶(NOS)、TF、LPC平均熒光強度(單位為mfi)，檢測細胞數目不應少于10 000個。

2 結 果

2.1兩組 DDAH mRNA水平分析 冠心病組DDAH mRNA相對表達量為(0.78±0.21)，對照組相對表達量為(1.28±0.51)，隨著患者Gensini積分升高，DDAH mRNA相對表達量顯著下降，與對照組相比，冠心病組ADMA含量顯著上升，且患者Gensini積分升高ADMA含量顯著升高，兩兩相比差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2兩組NOS、TF、LPC含量分析 冠心病組NOS、TF、LPC水平顯著高于對照組，且隨著Gensini積分升高，NOS、TF、LPC水平顯著增加(P<0.05)，見表2。

2.3DDAH、ADMA與NOS、TF、LPC相關性分析 經相關性分析可知，DDAH與NOS、TF、LPC呈負相關(r分別為-0.362、-0.376、-0.039，均P<0.05)，而ADMA與NOS、TF、LPC呈正相關(r分別為0.402、0.396、0.358，均P<0.05)。

表1 各組 DDAH mRNA、ADMA水平分析

表2 各組NOS、TF、LPC含量分析

3 討 論

目前普遍認為冠心病的發病機制是血栓的形成及動脈粥樣斑塊破裂引起的，而TF血栓及斑塊的形成過程中起到重要的促進作用〔6〕。血管內皮是血管間質細胞與血液之間的半透性膜，其對維持及穩定血流動力學具有重要的意義〔7〕。在正常狀態下，內皮細胞幾乎不產生TF，但當血管內皮出現病理性改變或血管功能形態受損時可誘導血管產生大量的TF，并激活纖維蛋白原及凝血酶原，進而促進血栓形成〔8〕。在NOS催化作用下，細胞中L-精氨酸可大量生成NO，NO是維持及穩定血管內皮功能的重要物質，可抑制血栓的形成〔9〕。

ADMA屬于內源性NOS抑制物，可抑制NO合成，進而對血管內皮造成損傷，破壞機體血流動力學平衡〔10〕。Davids等〔11〕長期給予小鼠ADMA物質，結果顯示ADMA可引起小鼠微血管粥樣化，與正常小鼠相比，其體內NO生成顯著減少。近期研究指出〔12〕，ADMA可誘導血管內皮細胞老化及凋亡，并可抑制血管新生，促使血管泡沫細胞形成，增加內皮細胞黏附，促進血栓形成。近年研究指出〔13〕，ADMA是以甲基化蛋白作為底物經甲基化轉移酶催化生成的，是由于DDAH代謝失活引起的，因此采用DDAH抑制劑可有效抑制DDAH基因過度表達。DDAH主要分布在內皮型NOS組織中。Ivashchenko等〔14〕研究指出在內皮細胞培養過程中增加NO濃度，能有效抑制DDAH活性，而降低DDAH活性則使得細胞內ADMA水平增加，從而抑制NOS活性，使得NO生成減少，因此DDAH-ADMA系統屬于內源性NO生成系統，DDAH-ADMA系統對維持及穩定血管內皮功能起到重要的調控作用。

本研究結果與伊桐凝等〔15〕一致，從而提示ADMA水平上升可抑制DDAH表達，且隨著患者病情的進展，DDAH的表達量顯著受到抑制。此外，本研究還提示ADMA水平上升與血管內皮功能障礙有密切關系，ADMA可誘導及促進內皮細胞老化及凋亡，介導機體炎癥因子生成，促進動脈粥樣硬化的形成。近年臨床實驗研究顯示，冠心病患者血漿ADMA水平顯著高于正常人群，且ADMA水平升高的患者其發生心血管事件的風險顯著上升，且預后效果較差。ADMA可介導DDAH表達下降，使得NOS、TF、LPC表達上調，且隨著患者病情的發展，DDAH水平顯著上升，NOS、TF、LPC表達量顯著增加，從而加重了對血管內皮的損傷。

綜上，冠心病病情的發生及進展與DDAH-ADMA通路參與NOS、TF、LPC表達有密切關系，通過對DDAH-ADMA系統對血管內皮細胞影響機制的研究，可更好地了解冠心病發病的機制，為臨床冠心病防治提供新的治療思路。

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