銀杏葉提取物對SKOV3種植性卵巢癌Bcl-2、Bax的影響

馬 哲 薛惠榮 黃秀英

(北華大學附屬醫院婦產科，吉林 吉林 132011)

銀杏葉提取物(EGb 761)主要應用于心腦血管疾病的防治〔1〕，而近年來的一些研究發現銀杏葉提取物對某些腫瘤具有抑制增殖的作用。研究顯示 EGb 761及內脂B可明顯降低乳腺癌細胞增殖〔2〕，給予銀杏葉提取物可抑制人結腸癌細胞HT-29增殖〔3〕，銀杏葉提取物山奈酚可通過誘導凋亡抑制胰腺癌細胞增殖〔4〕。研究還顯示銀杏葉提取物明顯遏制二乙基亞硝胺(DEN)誘發的肝癌增殖〔5〕以及 N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍誘發的 SD大鼠胃癌前病變〔6〕。但關于銀杏葉提取物對卵巢癌的研究資料目前尚無報道。本研究利用SKOV3細胞株構建裸鼠種植性卵巢癌模型，觀察銀杏葉提取物對卵巢癌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達的影響，從凋亡角度探討其中的機制。

1 材料與方法

1.1材料 銀杏葉提取物(商品名：金納多，德國威舒培大藥房)； Bax抗體、Bcl-2抗體、PV-6000 免疫組織化學試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；其他試劑為國產分析純。人卵巢癌細胞株SKOV3由吉林省腫瘤醫院提供。雌性4周齡裸小鼠，由北京云菱生物技術有限公司提供。

1.2方法 體外培養SKOV3細胞， 收集對數生長期細胞，生理鹽水調整至細胞數濃度為2×107/ml給予裸鼠皮下注射(0.2 ml/只)，接種2 w后，將成模裸鼠隨機分為模型組、銀杏葉提取物低劑量組(50 mg·kg-1·d-1)、銀杏葉提取物高劑量組(100 mg·kg-1·d-1)，每組10只。模型組及銀杏葉提取物各劑量組分別腹腔注射生理鹽水或相應濃度藥物1次/d，銀杏葉提取物組連續給藥3 w。3 w后處死動物，取出腫瘤稱重后固定于4%甲醛溶液中。免疫組織化學法檢測Bcl-2、Bax在移植瘤組織中的表達。

2 結 果

2.1各組動物狀態及瘤重 模型組動物狀態尚可，實驗至第16天時1只動物死亡，而給予銀杏葉提取物的動物狀態較好，體重無明顯下降，實驗期間無動物死亡。 與模型組比較，各治療組腫瘤重量均有降低趨勢，其中銀杏葉提取物高劑量組差異顯著(P<0.05)，瘤重抑制率達14.1%。見表1。

2.2腫瘤組織中Bcl-2、Bax蛋白表達情況 Bcl-2、Bax蛋白在模型組動物中均有較高水平的表達，陽性信號主要位于胞質。經銀杏葉提取物治療后的裸鼠腫瘤組織中Bcl-2的表達有所降低(P<0.05)，而Bax蛋白的表達有所升高(P<0.05)，特別是銀杏葉提取物組高劑量組變化較明顯。

表1 各組裸鼠體重及瘤重

A、D：模型組；B、E：銀杏葉提取物組低劑量組；C、F：銀杏葉提取物組高劑量組;A～C：Bcl-2；D～F：Bax

3 討 論

銀杏葉藥用史已有五千多年，有良好的用藥經驗，藥物毒性小。銀杏葉提取物成分復雜，有效化學成分多，藥理作用廣泛，其中多種物質具有抗氧化、清除自由基、促進凋亡等抗腫瘤的藥理基礎。多項研究已顯示銀杏葉提取物可抑制腫瘤或癌前病變的增殖，其中一些研究顯示，其抑制腫瘤的作用與腫瘤細胞凋亡密切相關〔2～7〕。銀杏葉提取物可降低人結腸癌細胞HT-29 中bcl-2 mRNA、提高p53 mRNA表達，從而誘導其凋亡〔3〕。在N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍誘發的SD大鼠胃癌前病變的研究中也顯示，銀杏葉提取物治療后大鼠Bcl-2、 c-myc及FasL等癌基因均表達降低，凋亡基因Fas 表達明顯升高〔6〕。此外，關于白血病細胞U937的研究也顯示，銀杏葉提取物中的銀杏酸成分可通過誘導凋亡明顯抑制U937的增殖〔7〕。

化療是卵巢癌的重要治療手段，關于銀杏葉提取物輔助化療的研究也有報道，如銀杏葉提取物聯合他莫昔芬治療乳腺癌大鼠，其療效優于他莫昔芬單獨治療組〔8〕。一項臨床Ⅱ期實驗也顯示給予胰腺癌病人5-氟尿嘧啶聯合銀杏葉提取物，病人耐受性強于單獨使用5-氟尿嘧啶〔9〕。

本研究發現銀杏葉提取物可以抑制卵巢移植瘤的增殖，給予銀杏葉提取物的SKOV3種植性卵巢癌裸鼠瘤重有降低趨勢，但本實驗中銀杏葉提取物瘤重抑制程度并不高，主要原因考慮為銀杏葉提取物作用緩和，而本模型為短療程治療。

Bcl-2和Bax 是一對凋亡調節蛋白，Bax自身可形成同源二聚體，同源二聚體Bax/Bax的比例大于異源二聚Bcl-2/Bax時可促進細胞的凋亡，反之則抑制細胞凋亡。本實驗結果顯示，給予銀杏葉提取物的動物Bcl-2表達明顯降低，而Bax的表達明顯增高，并呈劑量依賴性。提示銀杏葉提取物可能通過促進腫瘤細胞凋亡從而抑制卵巢移植瘤的生長。

4 參考文獻

1顧學裘.銀杏藥學研究與臨床開發〔M〕.北京: 中國醫藥科技出版社,2004：17-31.

2Papadopoulos V,Kapsis A,Li H,etal.Drug-induced inhibition of the peripheral-type benzodiazeetalpine receptor expression and cell proliferation in human breast cancer cells〔J〕.Anticancer Res,2000;20(5A):2835-47.

3Chen XH,Miao YX,Wang XJ,etal.Effects of Ginkgo biloba extract EGb761 on human colon adenocarcinoma cells〔J〕.Cell Physiol Biochem,2011;27(3-4):227-32.

4Zhang Y,Chen AY,Li M,etal.Ginkgo biloba extract kaempferol inhibits cell proliferation and induces apoptosis in pancreatic cancer cells〔J〕.J Surg Res,2008;148(1):17-23.

5Dias MC，Rodrigues MA，Reimberg MC，etal.Protective effects of Ginkgo biloba against rat liver carcinogenesis〔J〕.Chem Biol Interact，2008;173(1):32-42.

6Jiang XY,Qian LP,Zheng XJ,etal.Interventional effect of Ginkgo biloba extract on the progression of gastric precancerous lesions in rats〔J〕.J Dig Dis,2009;10(4):293-9.

7Yang XM，Chen YC，Chen J，etal.Apoptosis study on human or leukaemia cell line U937 induced by ginkgolic acids from Ginkgo biloba L〔J〕.Food Sci，2006;27: 241- 6.

8Dias MC,Furtado KS,Rodrigues MA,etal.Effects of Ginkgo biloba on chemically-induced mammary tumors in rats receiving tamoxifen〔J〕.BMC Complement Altern Med,2013,doi: 10.1186/1472-6882-13-93.

9Hauns B,H?ring B,K?hler S,etal.Phase Ⅱ study with 5-fluorouracil and ginkgo biloba extract(GBE 761 ONC)in patients with pancreatic cancer〔J〕.Phytother Res,2001;15(1):34-8.