PKC-α蛋白及mRNA轉錄水平在妊娠期高血壓大鼠腎臟中的表達及意義

楊宏靜

(三峽醫藥高等專科學校，重慶 404120)

妊娠高血壓(簡稱妊高征)，是妊娠期婦女所特有而又常見的疾病，以高血壓、蛋白尿、水腫、抽搐、昏迷、心腎衰竭甚至發生母子死亡為臨床特點〔1〕。妊高征綜合征按嚴重程度分為輕度、中度和重度，重度妊娠高血壓綜合征又稱先兆子癇和子癇，即在高血壓基礎上有抽搐〔2〕。妊高征的生理病理改變非常廣泛，全身小動脈的痙攣是基本病變，小動脈痙攣可導致多器官系統(如心臟、腎臟、肝臟等)的病理性損害，其中腎功能損傷是妊高征的早期發病特征〔3，4〕。有研究認為，蛋白激酶C(PKC)與妊高征疾病腎臟損害存在著相關關系，本研究通過檢測妊高征疾病大鼠腎臟中PKC-α蛋白水平和mRNA轉錄水平，從而了解PKC-α蛋白及mRNA轉錄水平在妊高征疾病大鼠腎臟中的表達意義。

1 材料和方法

1.1實驗動物與試劑 實驗動物：清潔級Wistar大鼠48只(體重200～250 g， 14～16 w)。試劑：亞硝基左旋精氨酸甲酯、生理鹽水、乙醚、PKC鼠抗體(美國Santa Cruz公司)、堿性磷酸酶耦聯的山羊抗兔IgG(美國Santa Cruz公司)、顯色試劑盒、Trizol RNA抽提試劑(美國Promega公司)、RT-PCR一步法試劑盒(美國Promega公司)、TaqDNA聚合酶(上海生工公司)。

1.2動物模型的建立及分組 妊娠鼠模型的建立：將16只Wistar雌性大鼠和32只雄性大鼠以1∶2合籠，第2天早晨取雌鼠陰道分泌物鏡檢，若發現了精子，則動物模型建立。

分組及處理：將妊娠鼠隨機均分為妊娠期高血壓疾病組(疾病組)和正常妊娠組，每組妊娠鼠8只；剩余的8只未交配健康孕齡雌鼠為未妊娠組。疾病組妊娠鼠于妊娠第13天(陰道分泌物確認有精子時刻即為妊娠第1天)開始皮下注射亞硝基左旋精氨酸甲酯，注射250 mg/kg；正常妊娠組妊娠鼠則于妊娠第13天注入生理鹽水，注射250 mg/kg，1次/d。三組所有雌鼠均在妊娠第21天在乙醚麻醉下打開腹腔，取出腎臟，腎臟樣本置于液氮保存待用。

1.3Western印跡雜交〔5〕在取得的腎臟組織中加入5倍體積的緩沖液，在冰浴下用玻璃研磨器(15 000 r/min，30 min)粉碎，后加入細胞裂解液裂解細胞，靜置后取其上清液，所得即為胞漿蛋白。將所有的胞漿蛋白樣本置于十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠上電泳(5～6 h)，之后進行電轉印。然后用1∶200的PKC鼠抗體進行Western印跡，印跡后用1∶2 000二抗性堿性磷酸酶耦聯的山羊抗兔IgG抗體處理，利用顯色試劑盒對各樣本圖像進行檢測和攝影。

1.4RT-PCR半定量測定〔6〕鼠腎臟組織總RNA采用Trizol一步法進行提取，嚴格按照逆轉錄試劑盒的說明進行操作，擴增PKC-α的PCR產物后，檢測其mRNA含量。PCR反應各步驟的條件分別為：熱啟動：94℃，3 min；擴增、變性：94℃，30 s；退火：58℃，1 min；延伸：72℃，2 min，共進行32個循環，最后72℃延伸8 min。PKC-α引物序列：正義：5′-TGA ATC GTG AGT GGA ATG AGT-3′，反義：5′-GGT TGC TTT GTC TCT TCT GAA-3′，擴增片段長度293 bp；β-actin引物序列：正義：5′-GTG GGC CGG TGT AGG CAC CAT-3′，反義：5′-GGT TGG CCT TAG GGT TCA GGA-3′，擴增片段500 bp。PCR產物置于12%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳后，通過UVP凝膠成像分析系統對其表達進行掃描分析電泳條帶的灰度值，PKC-α mRNA表達的相對含量=mRNA條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行分析，行一般統計描述、t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1三組腎組織樣本的PKC-α表達水平比較 三組腎組織樣本均有PKC-α表達，三組間的PKC-α表達水平有統計學差異(P<0.05)；疾病組與未妊娠組腎組織樣本的PKC-α表達水平均高于正常妊娠組(均P<0.05)。見圖1。

2.2三組的腎組織樣本PKC-α的mRNA轉錄比較 三組的腎組織樣本的PKC-α 的mRNA轉錄水平存在統計學差異(P<0.05)，其中妊高征疾病組與未妊娠組的腎組織樣本PKC-α的mRNA轉錄水平均高于正常妊娠組(P<0.05)。

圖1 PKC-α Western印跡結果

圖2 PKC-α RT-PCR結果

3 討 論

PKC屬于絲蘇氨酸蛋白激酶家族，激活的PKC可使多種蛋白的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化，從而影響細胞內生物信息的傳遞，在調節細胞代謝、分化、增殖乃至癌變中具有十分重要的作用；其次，PKC還是Ca2+磷脂依賴性蛋白激酶，廣泛存在于組織細胞中，在靜息狀態下，PKC主要以無活性的形式存在于細胞質中，當受到外界刺激時PKC從細胞質向細胞膜轉移，從而發揮其活性作用；PKC可參與一系列與生命現象相關的過程，如：介導細胞增殖與分化、影響細胞周期和細胞凋亡、調節基因表達、參與代謝調節及控制細胞膜功能等；最后，PKC是細胞內諸多信號傳導系統、信號傳導系統間相互影響的中心環節，而信號傳導系統可以通過細胞外刺激來調節細胞的收縮、舒張、增殖分化以及細胞內有關物質的合成等〔7～9〕。

PKC在腎臟中廣泛存在，在維持和調節腎臟的功能方面起重要作用。PKC介導妊高征疾病腎臟病變機制為：PKC可改變磷酸化激動蛋白的功能和結構，增大內皮細胞間隙，降低細胞與細胞以及細胞與基質間的連接，從而增加腎臟細胞的通透性，導致尿蛋白〔10〕；PKC在細胞內被激活后，可催化多種蛋白質的磷酸化反應，對血管平滑肌細胞的增生和收縮功能起著重要的調節作用；再次，PKC可降低細胞內的Na-K-ATP酶活性〔11〕；PKC-α為PKC的一個亞型，除具有PKC的以上功能外，國內外研究發現PKC-α可激活有絲分裂原活化的蛋白激酶途徑，進而改變腎內血流的動力學狀態，提高內皮細胞對白蛋白的通透性和增加轉化生長因子(TGF-β)的表達；另外，PKC-α活化后可磷酸化PKC內源性底物，通過胞內一系列的信號轉導機制誘導血管通透因子(VPF)的產生，從而引起蛋白尿〔12〕。

綜上，妊高征疾病大鼠腎臟中的PKC-α蛋白及mRNA轉錄水平表達較高，PKC-α蛋白可能是導致妊高征疾病腎臟損傷的因素之一。

4 參考文獻

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