神經生長因子對木糖誘導白內障大鼠晶狀體的保護作用

劉宏偉 孟 巖 張 劍 姜 偉 王玉清

(佳木斯大學附屬第一醫院眼科，黑龍江 佳木斯 154002)

我國目前就有白內障患者500多萬，急需手術治療的白內障盲人就有近200萬，每年新增的白內障盲人就有約(40～120)萬，白內障目前還沒有明確有效的治療藥物，治療手段主要是手術治療，而手術畢竟是一種創傷性治療手段且費用較高。研究表明大多數動物細胞應激反應時，過量表達神經生長因子(NGF)〔1〕。本研究擬探討NGF對白內障大鼠的保護作用及發病機制。

1 材料和方法

1.1實驗藥品與試劑 199培養基、小牛血清、外源性NGF、D-木糖、NGF抗體、抗兔二抗均購自上海圻明生物科技有限公司，離心機、酶聯免疫檢測儀等由佳木斯大學生命科學實驗中心提供。

1.2動物分組 Wistar大鼠40只(由佳木斯大學實驗動物中心提供)，體質量(180±20)g，隨機分為空白對照組、模型組、NGF組、對照組，每組各10只，適應性喂養1 w后，采用10%水合氯醛麻醉并在無菌條件下處死大鼠，并取大鼠眼球，冰冷生理鹽水沖洗后浸入0.1%新潔爾滅溶液1 min，再以新鮮除菌培養液沖洗數次，然后在無菌操作下解剖眼球取出晶體，分別投入試管中，每個試管中含液體3 ml，空白對照組試管中加入199培養液60%，小牛血清40%。模型組試管中加入199培養液60%，0.29 mol/L D-木糖溶液20%，小牛血清20%。NGF組試管中加入199培養液20%，0.29 mol/L D-木糖溶液20%，小牛血清20%，NGF 40%。對照組試管中加入199培養液20%，0.29 mol/L D-木糖溶液20%，小牛血清20%，生理鹽水40%，加蓋后置于37℃水育箱中培養。分別在24、48、72 h觀察晶狀體渾濁度，并用酶聯免疫吸附(ELISA)法測定空白對照組和模型組內源性NGF的含量。

1.3晶體渾濁度觀察 按照何守志等〔2〕報道的方法對晶狀體混濁程度進行分期并計分：0期：用裂隙燈顯微鏡觀察晶體清晰透明，計 0分；Ⅰ期：囊泡初期，晶體周邊部皮質出現細小囊泡或細小囊泡群，計1 分；Ⅱ期：囊泡期，晶體皮質區呈現細小囊泡，中等囊泡自赤道部向前皮質擴展，逐漸形成環狀或戒指狀，囊泡群環帶逐漸加寬至前皮質的 1/2～ 2/3 半徑，計 2分；Ⅲ期：皮質期，晶體皮質呈現不規則條紋狀、箭竹狀并向前極放射的混濁灶，逐漸形成彌漫性灰色至灰白色混濁，晶體核尚透明，計3分；Ⅳ期：核混濁期，除晶體皮質灰白混濁外，晶體核密度增高，出現致密灰色至乳白色或白色混濁，計4分；Ⅴ期：成熟白內障期，晶狀體皮質及核完全呈灰白色混濁，計5分。

1.4ELISA 利用鼠β-NGF ELISA試劑盒按產品說明書步驟進行操作，收集各組晶狀體勻漿上清液，加入預先包被有NGF多克隆抗體的96孔板內，4℃孵育24 h。洗去多余抗體，加入生物素標記的兔抗鼠IgG室溫孵育2 h。最后加入終止液，37℃孵育25 min。在酶聯免疫檢測儀(Bio-Rad 680)OD 450 nm處測量各孔吸光值，系統精密度為最小1.0 ng/ml。每組樣品重復實驗2次。

1.5統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析和q檢驗。

2 結 果

空白對照組晶狀體渾濁度分數1分，模型組120分，對照組112分，NGF組79分。模型組較空白對照組渾濁度系數明顯增高(P<0.05)。而NGF組較對照組渾濁度系數明顯降低(P<0.05)。見表1。

模型組24、48、72 h NGF濃度〔(18.951±4.021)、(10.173±11.511)、(6.098±20.001)pg/ml〕均明顯高于空白對照組〔(0.375±0.021)、(0.897±0.083)、(1.145±1.003)pg/ml〕(P<0.05)。模型組24、48、72 h NGF濃度隨時間推移而下降(P<0.05)。

表1 各組大鼠在24、48、72 h晶狀體渾濁度(n=10)

3 討 論

現已公認晶狀體透明度的維持是由其組成蛋白質的構象決定的，天然蛋白的穩定性決定了蛋白構象的穩定，蛋白質四級結構的維持依賴于新合成多肽的合理折疊和細胞對環境或病理生理應激產生的足夠的保護作用。蛋白質天然結構的不穩定導致晶狀體的混濁，因而詳細了解晶狀體蛋白如何長期維持其天然結構是非常必要的。晶狀體獨特的解剖位置使其長期暴露于一種應激的環境中。 由于晶狀體沒有直接的血供，因此一些必不可少的生物大分子如氧或氨基酸的供應是有限的，而代謝廢物如毒素、炎性物質在附近長期保留。 所以，晶狀體需要特殊的保護作用以抵抗微環境誘導的應激。如果沒有這樣的保護作用，晶狀體蛋白質將降解而導致白內障。NGF能夠促進發育中的感覺神經元及交感神經元的存活和分化，營養成熟神經元，維持其正常的生物學功能，具有抑制細胞凋亡〔3〕，保護視神經的作用迅速成為生命科學界所矚目的焦點〔4〕。

本實驗提示NGF可延緩白內障的發生，可以作為白內障疾病一種新的治療途徑。NGF在身體各部位都可發現其表達，尤其是在機體受到外界因素干擾時，含量可增高。機體自身存在一定的內源性NGF，特別是在加入D-木糖后，晶狀體中內源性NGF含量也明顯增高，這一現象說明機體存在一定的自我保護作用，但其作用較微弱，達不到抑制晶狀體渾濁的作用。白內障的發生可減少NGF的產生，從而降低NGF對晶狀體的保護作用。

4 參考文獻

1Leppa S，Kajanne R，Arminen L，etal.Differentiation induction of HSP70-encoding genes in human hematopoietic cells〔J〕.J Biochem，2001；276：31713-9.

2何守志，尹素云，宋 深.半乳糖性白內障形成及逆轉的實驗研究〔J〕.中華眼科雜志，1987;23(1):39-42.

3王麗輝，童坦軍.神經生長因子〔J〕.生物化學與生物物理學進展,1998;19(1)：29.

4Lindsay RM，Hamer AJ.Nerve growth factor regulates expression of neuropeptide genes in adult sensory neurons〔J〕.Nature，1989;337：362.