脾虛老齡大鼠腸黏膜sIgA、CD3、CD8水平變化及四君子湯對其的影響

張 博 竇逾常 王垂杰

(遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032)

脾為人體正常生命活動提供必需的營養物質，維持人體的內外平衡，抵御外邪。脾胃不足，則氣血兩虛，可致病理性早衰。同時，衰老時所表現的精血不足與脾氣薄弱、運化失司，后天乏源有很大關系。所以，脾氣健運在祛病復健的同時,又可收緩衰延年之功。脾虛可使機體抵御外邪功能下降，免疫功能降低等。腸道不但是食物消化吸收的場所，而且可能是發揮局部免疫效應從而影響整體免疫的主要場所〔1〕。腸道黏膜免疫既是機體系統免疫的重要組成部分,同時又具有相對獨立性。很多研究發現，脾虛時胃腸黏膜分泌功能紊亂，免疫功能低下，因而胃腸道局部免疫狀態在脾虛證研究中十分重要。本實驗擬探討脾虛老齡大鼠腸黏膜分泌性免疫球蛋白IgA (sIgA)、CD3、CD8細胞百分率，及四君子湯對其的影響。

1 材料和方法

1.1動物分組 SD雄性大鼠40只，21～22月齡，體重450～600 g (由遼寧中醫學院動物室提供)。分籠，標準飼料喂養1 w后按隨機數字表法分成正常對照組、長期造模組、造模恢復組和四君子湯組。除正常對照組外，其余3組均制作大鼠長期脾虛模型。① 正常對照組大鼠常規喂養，生理鹽水4 ml/只灌胃，隔日1次，共7 w。②長期造模組大鼠予小承氣湯(1.5 ml/100 g)灌胃，當日禁食不禁水，隔日1次，同時隔日足量喂食且游泳至耐力極限1次(以口鼻首次沒入水中為準)，共7 w。③造模恢復組前4 w喂養同長期造模組，4 w后改為常規飼養，共7 w。④四君子湯組前4 w同長期造模組；4 w后改為常規飼養，同時用四君子湯灌胃3 w，(1.5 ml/100 g),1次/d。于第10周末處死大鼠后取材處理。

1.2主要儀器與試劑 電熱恒溫培養箱，HH·B11·500型，上海躍進醫療器械廠生產。微量移液器，美國熱電公司生產。酶標儀，anthos2010型。流式細胞儀，BD FACSCalibur 。電子天平，JY5002型，0.01～500 g，上海精密科學儀器有限公司生產。電子天平，BS223S型，0.001～220 g，北京賽多利斯儀器系統有統公司生產。ELISA酶免疫試劑盒,美國ADL公司。FITC Conjugated anti-rat CD3，PEConjugated anti-rat CD8， eBioscince，沈陽寶信科技有限公司提供。小承氣湯由厚樸、枳實、大黃(比例3∶3∶2)組成；四君子湯由黨參、白術、茯苓、甘草(比例2∶2∶2∶1)組成，均由遼寧中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供，并由該院制劑室制成100%煎劑。

1.3測定方法

1.3.1sIgA測定 距幽門下 15 cm 處及回盲部腸組織5 cm，刮取小腸黏膜組織，經溶解、離心后取上清，采用酶聯免疫吸附(ELISA)雙抗體夾心法檢測各組大鼠回腸黏膜中sIgA含量，嚴格按照試劑盒中說明書步驟進行操作。于450 nm處檢測各孔吸光度(OD)值，根據標準品濃度及相應OD值擬合標準曲線及方程，計算各檢測孔sIgA濃度。

1.3.2CD3、CD8細胞百分率測定 距回盲部5 cm處回腸組織約10 cm，沿中線剪開腸管，用載玻片刮取腸內組織，300目銅網過濾，制成腸組織細胞懸液，2 000 r/min離心10 min，去上清，加10 ml PBS混勻后過濾2次，加入3 ml淋巴細胞分離液，離心，取白色分層，預冷的PBS洗滌2次，懸浮至1 ml，調整細胞濃度至1×104～1×105，取1 ml細胞懸液，取專用試管4支，每管中加入細胞懸液100 μl，然后依次加入CD3-FITC、CD8-PE抗體及其同型對照抗體，充分混勻，室溫避光孵育30 min。1 500 r/ min，離心5 min，去上清。用2 ml PBS洗滌2次，加入PBS 0.5 ml懸起，4℃避 光1 h內 在BD FACSCalibur流式細胞儀上進行檢測，Cell-quest 軟件分析數據。

2 結 果

2.1各組大鼠腸組織中sIgA 與空白對照組〔(68.52±12.71)ng/ml〕相比，脾虛各組腸組織中sIgA含量均有下降，其中四君子湯組sIgA含量〔(32.22±5.33)ng/ml〕高于造模恢復組〔(24.47±7.12)ng/ml〕，造?；謴徒M高于長期造模組〔(22.56±4.31)ng/ml〕(P<0.01或P< 0.05)。

2.2各組大鼠腸組織中CD3、CD8細胞百分率 與空白對照組相比，脾虛各組腸組織中CD3、CD8細胞百率均下降，其中四君子湯組CD3、CD8細胞百分率高于造模恢復組，造模恢復組高于長期造模組(P<0.01)。 見表1。

表1 各組大鼠腸組織中CD3、CD8細胞百分率

3 討 論

腸黏膜免疫系統由彌漫分布于腸黏膜上皮內和固有層的免疫細胞、免疫分子及潘氏結(PP結)等腸黏膜相關性淋巴組織(GALT)組成。功能上分為B、T淋巴細胞, 分別具有體液免疫和細胞免疫的作用,產生免疫應答〔2〕，參與構成機體抵抗外界入侵的第一道防線,在腸道免疫功能的調節過程中起重要作用。腸黏膜內T淋巴細胞可以發揮細胞毒作用以保護腸隱凹干細胞分化出的新生上皮細胞，使其順利完成向腸絨毛頂部遷移過程，從而維持腸上皮細胞的完整性，同時它也向B細胞、漿細胞傳遞活化信息；而漿細胞是已活化的B細胞，它能分泌 IgA 并以 sIgA的形式進入腸腔中與腸腔內的病菌結合，使其能黏附到腸黏膜上從而阻止其位移，或直接中和其毒性。T細胞和B細胞對于維持腸黏膜的完整性、順利發揮其屏障作用具有重要的意義。

sIgA和CD3分布和數量可以反映腸黏膜局部的細胞免疫及體液免疫功能。CD3是所有T細胞的共同標志，CD3作為T細胞抗原受體, 為信號轉導亞單位, 能將TCR接受的抗原刺激信號轉導至細胞內, 使T細胞活化, 在T細胞免疫中起著必不可少的作用〔3〕。CD3+T淋巴細胞可以抑制 TLR途徑激活的固有免疫反應，防止促炎癥細胞因子作用，減少內毒素的產生〔4，5〕。CD8淋巴細胞是免疫反應的效應細胞,參與抗病毒、移植排斥反應及對非己抗原誘發的免疫應答的抑制，其數量的增多或減少可間接反映人體的免疫功能〔6，7〕。slgA進入腸道能選擇性地包被革蘭陰性菌,形成抗原抗體復合物,阻礙細菌與上皮細胞受體相結合,同時刺激腸道黏液分泌并加速黏液層的流動,可有效地阻止細菌對腸黏膜的粘附。此外,slgA還可以中和腸道病毒,具有中和毒素、溶解細菌及免疫排除等作用。

4 參考文獻

1Zhao HY，Luo YY，Lu C，etal. Enteric mucosal immune response might trigger the immunomodulation activity of ganoderma lucidumpolysaccharide in mice〔J〕. Planta Med，2010；76(3)：223-7.

2任宏宇, 鄒開芳. 炎癥性腸病腸黏膜組織內淋巴細胞激活和效應應答〔J〕.世界華人消化雜志,2008;16:3178-80.

3張有聰, 劉淑英. T淋巴細胞和B淋巴細胞的研究進展〔J〕.畜牧與飼料科學,2006;27:75-8.

4Kim KD, Zhao J, Auh S,etal. Adaptive immune cells temper initial innate responses〔J〕. Nat Med, 2007; 13(10):1248-52.

5Zhao J, Yang X, Auh SL,etal. Do adaptive immune cells suppress or activate innate immunity〔J〕. Trends Immunol, 2009;30(1):8-12.

6Burgdorf S, Kautz A, Bohnert V,etal. Distinct pathways of antigen uptake and intracellular routing in CD4 and CD8 T cell activation〔J〕. Science,2007;316:612-6.

7Dace DS, Chen PW, Niederkorn JY. CD8+T cells circumvent immune privilege in the eye and mediate intraocular tumor rejection by a TNF-alpha dependent mechanism〔J〕.J Immunol,2007;178:6115-22.