小柴胡湯對C6膠質瘤大鼠微血管密度和腫瘤細胞增殖活性的影響

于慧玲 麻春杰 蓋 聰

(北京中醫藥大學，北京 100029)

C6膠質瘤一般為膨脹性或侵襲性生長，其血管的生成和腫瘤細胞的不斷增殖，在C6膠質瘤的發生、發展中具有重要的意義〔1〕。小柴胡湯為中醫經典方劑，臨床應用廣泛，近年來其在腫瘤治療方面的應用日益引起人們的重視〔2〕，本實驗采用免疫組織化學方法檢測腫瘤組織的微血管密度(MVD)反映腫瘤的微血管生成情況；同時通過檢測增殖細胞核抗原(PCNA)的表達反映腫瘤細胞的增殖活性，旨在探討小柴胡湯的抑瘤機制，為其進一步推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 小柴胡湯組成：柴胡(78.125 g)、黃芩(46.875 g)、人參(46.875 g)、清半夏半升(42 g)、炙甘草(46.875 g)、生姜(46.875 g)，大棗(30 g)。替莫唑胺由江蘇天士力帝益藥業有限公司提供；ELISA試劑盒：CD34和PCNA均由南京建成生物有限公司提供；一抗CD34和PCNA購于北京博奧森生物有限公司；SP9710試劑盒和二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購于福州邁新生物有限公司。

1.2實驗分組及模型制備〔3〕清潔級Wistar 老年雄性大鼠，體重(321.5±3.3)g，18月齡， 60只右前肢腋窩皮下接種2×106/20 μl的C6膠質瘤細胞懸液；隨機分為腫瘤對照組、陽性藥A組(替莫唑胺50 mg/kg)、陽性藥B組(替莫唑胺25 mg/kg)、小柴胡湯C組(50 g/kg)、小柴胡湯D組(20 g/kg)、小柴胡湯E組(10 g/kg)。

1.3中藥制備 小柴胡湯組成中的7味中藥，以8倍量蒸餾水浸泡30 min，加熱保持微沸30 min，過濾；殘渣加6倍量蒸餾水，微沸30 min，過濾，合并2次濾液，混合后濾液干燥濃縮至100 ml，即小柴胡湯E(10 g/ml)；以類似方法濃縮熬制小柴胡湯D(20 g/ml)；小柴胡湯C(50 g/ml)；4℃冰箱保存備用。

1.4給藥方法及取材 每組均分別灌胃給予生理鹽水、陽性藥A、陽性藥B、小柴胡湯C、小柴胡湯D和小柴胡湯E，連續服藥5 d，休息4 d，共給藥3次，于最后1次給藥后2 d處死動物，眼球取血，分離血清3 000 r/min，10 min，標記好后置-20℃保存備用；取腫瘤組織(部分-20℃凍存待測，部分固定于10%甲醛液中)。

1.5檢測指標

1.5.1大鼠血清及腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白含量的檢測 采用ELISA酶聯免疫法檢測；嚴格按照試劑盒方法操作。

1.5.2大鼠腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白水平的檢測 采用免疫組織化學方法檢測；腫瘤組織脫水、包埋、切片4 μm，60℃烤箱烘烤6 h待測。

1.5.3大鼠腫瘤組織中MVD和增殖指數的檢測 MVD的計數是在200倍光學顯微鏡下，連續計數5個視野的微血管數的平均值；增殖指數的檢測：在200 倍光學顯微鏡下，連續計數5個視野的PCNA陽性細胞數/計數的細胞總數。

2 結 果

2.1各組大鼠血清及腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白含量的比較 與腫瘤對照組比較，小柴胡湯各劑量組大鼠血清及腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白含量均降低，且隨劑量增長降低趨勢明顯(P<0.01)，陽性藥各劑量組大鼠血清及腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白含量亦均降低，且隨劑量增長降低趨勢明顯(P<0.01)。見表1。

2.2各組大鼠腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白水平陽性強度的比較 與腫瘤對照組比較，小柴胡湯各劑量組大鼠腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白陽性表達強度均降低(P<0.01)，C組、D組降低較為顯著但二者之間差異無統計學意義(P>0.05)；陽性藥各劑量組大鼠腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白陽性表達亦均降低，且隨劑量增長降低趨勢明顯(P<0.01)，陽性藥A組、小柴胡湯C組和D組之間差異無統計學意義(P>0.05)；CD34和PCNA蛋白陽性表達強度采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統檢測灰度值，灰度值越大陽性表達越低，灰度值越小陽性表達越高。見表2。

2.3各組大鼠腫瘤組織中MVD和增殖指數的比較 與腫瘤對照組比較，小柴胡湯和陽性藥各劑量組大鼠腫瘤組織中MVD和增殖指數均下降(P<0.01)，陽性藥A組、小柴胡湯C組和D組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 小柴胡湯對C6膠質瘤大鼠血清、腫瘤組織中CD34、PCNA蛋白含量的影響

表2 小柴胡湯對C6膠質瘤大鼠腫瘤組織中CD34、PCNA蛋白水平(灰度值)和MVD、增殖指數的影響

2.4腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白、MVD和增殖指數的相關性比較 腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白呈正相關(r=0.735，P<0.01)，MVD和增殖指數亦呈正相關(r=0.726，P<0.01)。

3 討 論

大量研究〔4〕表明，腫瘤的生長和擴散與血管的形成密切相關，新生血管不僅為腫瘤組織的生長繁殖提供血供及氣體營養，更為腫瘤細胞的浸潤、轉移提供了可靠的通道。CD34是一種特異度較高的血管內皮細胞標志物，通過抗體與相應的內皮細胞結合，可以直接反映MVD的生成狀況，目前許多學者將腫瘤MVD作為腫瘤微血管生成的標志進行研究〔5，6〕。PCNA表達于腫瘤細胞的細胞核，是一種細胞增殖相關蛋白，反映細胞的增殖活性；它是一種僅在增殖細胞中合成與表達的酸性非組胺核蛋白，是DNA復制合成過程中的必需物質，并且在DNA修復過程中發揮重要作用，它的表達僅局限于細胞核內；它在增殖細胞周期中含量的變化與DNA復制時相變化具有一致性，是評價細胞增殖的良好指標〔7，8〕。C6膠質瘤生長迅速且呈惡性侵襲性發展，其中廣泛間質微血管形成是膠質瘤生長的生物學基礎，腫瘤細胞的增殖活性及腫瘤的微血管形成在腫瘤的生長和轉移中發揮重要核心作用，但目前關于膠質瘤血管生成的機制尚不清楚，因此PCNA和CD34的表達狀況與腫瘤的侵襲性、發生、發展密切相關。

綜上，小柴胡湯可抑制C6膠質瘤細胞的增殖活性及微血管形成，降低腫瘤組織PCNA和CD34的陽性率，但其間的相互關系及機制仍需進一步研究加以論證。本研究結果也為進一步探討腫瘤細胞的增殖與微血管形成間的相關性及PCNA和CD34的靶向治療提供一定參考。

4 參考文獻

1王金環,李 牧,王守倫.腦膠質瘤局部緩釋化療的研究進展〔J〕.神經疾病與精神衛生,2001;1(4):59-60.

2于紹華.小柴胡湯抗腫瘤作用的研究進展〔J〕.藥學服務與研究,2012;12(1):45-8.

3王曉剛,魏學忠,周定標.Wistar 大鼠C6膠質瘤動物模型的腫瘤生長特點〔J〕.軍醫進修學院學報,2001;22(4):300-2.

4錢金方.增殖細胞核抗原在常見腫瘤的研究進展〔J〕.腫瘤基礎與臨床,2008;21(4):86-9．

5王艷芬,丁永玲,李家馭,等.Ang-2、CD105 和CD34 在腦膠質瘤中的表達及生物學意義〔J〕.現代腫瘤醫學,2008;16(1):23-6.

6章必成,楊 波,劉 健,等.肺腺癌瘤周微淋巴管密度的檢測及其預后意義〔J〕. 臨床腫瘤學志,2010;15(11):978-82．

7王亞萍,辛曉燕,王 健.增殖細胞核抗原在卵巢上皮性腫瘤中的表達及其意義〔J〕.青海醫藥雜志,2004;34(4):13-5.

8馬文群,李利敏,宋國智.增殖細胞核抗原與腫瘤關系的研究進展〔J〕.河北醫藥,2011;33(1):600-2.