細胞凋亡和細胞自噬在慢性環孢素A腎毒性中的作用

羅 康 樸尚國 金英順 鄒洪斌 苗里寧 金 華 李 燦

(延邊大學附屬醫院腎內科，吉林 延吉 133000)

慢性環孢素 A (CsA) 腎毒性以腎小管間質帶狀纖維化為特征性病理改變，其分子發病機制不清，可能與炎性介質、局部腎素血管緊張素系統、轉化生長因子β1、氧化應激、細胞凋亡等〔1，2〕諸多因素相互作用有關，其中氧化應激扮演著重要角色。長期使用CsA可誘導氧化應激損傷，而氧化應激直接導致腎小管上皮細胞凋亡。與細胞凋亡類似，細胞自噬也將導致大量的腎實質細胞死亡從而形成硬化和纖維化。最近研究〔3,4〕表明，細胞自噬參與了多種腎臟病的發病，如糖尿病腎病、單側輸尿管梗阻模型，而且細胞自噬與氧化應激緊密相關。本研究擬利用慢性CsA腎毒性大鼠模型揭示細胞凋亡和細胞自噬在腎小管間質纖維化(TIF)中的作用。

1 材料和方法

1.1動物模型 雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Technology, 韓國), 體重220～230 g, 喂食低鹽飼料1 w后(0.05% sodium, Teklad Premier, Madison, WI, 美國) 隨機分成兩組：對照組(vehicle,VH,n=8)：皮下注射橄欖油 (1 ml·kg-1·d-1, Sigma，美國) 4 w；CsA毒性組(n=8) 皮下注射CsA(15 mg·kg-1·d-1, Novartis Pharma, Basel, 瑞士) 4 w。

1.2基本測定 每日給藥時測定大鼠的體重并記錄。4 w后處死大鼠前，將大鼠放入代謝籠中(Tecniplast Gazzada S. a r.l., 意大利)，留取尿液，眼眶取靜脈血，利用全自動生化分析儀(Coulter-STKS, Coulter Electronics, 美國)測定血清肌酐和血尿素氮。血CsA濃度是用單克隆抗體放射免疫分析法(Monoclonal Radioimmunoassay, Incstar, Stillwater, MN)測定。

1.3腎臟病理 處死大鼠時留取腎組織，由過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液固定, 石蠟包埋后切片厚4 μm。脫蠟后行三色染色。TIF程度在每張切片上至少觀察20個非重疊區域，用數字化顯微鏡分析儀(TDI Scope EyeTMVersion 3.0 for Windows, Olympus, 日本)，在100倍顯微鏡下，每張切片上至少觀察非重疊20個不同區域，獲取圖像，利用 Polygon Program定量計算腎皮質受損部位的百分比(%/0.5 mm2)。由兩個觀察者對每個樣本隨機進行盲法評分，取平均值。

1.4細胞凋亡的檢測 石蠟包埋切片置二甲苯脫蠟和梯度酒精中脫水后，按 In Situ Apoptosis 測定試劑盒說明步驟，檢測細胞凋亡。每張切片上至少觀察20個非重疊區域，數字化顯微鏡分析儀(TDI Scope EyeTMVersion 3.0 for Windows, Olympus, 日本)對原位末端標記法(TUNEL)陽性細胞進行計數，取平均值。

1.5ELISA法檢測血、尿8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG) 留取的血、尿樣在4℃，轉速為12 000 r/min，離心半徑為8.84 cm的離心機下離心5 min，取上清液，根據ELISA試劑盒(Shizuoka，日本)步驟檢測。

1.6免疫印跡法 提取的腎組織用蛋白質溶解緩沖液(10 mmol/L Tri-Cl, pH7.6; 150 mmol/L NaCl; 1% Sodium deoxycholate; 1% Triton X 100; 0.1% Sodium dodecyl sulfate; 1% aprotinin; 2 mmol/L Na3VO4; 1 μg/ml leupeptin; 1 mmol/L PMSF) 制成勻漿; 4℃下離心(1 500 r/min) 后, 取上清液測定蛋白濃度 (Bio-Rad, Hercules); 20 g 標本在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE); 電轉膜 (90 V) 2 h后, 4℃下置Bcl-2抗體于非脂牛乳中以1∶1 000 濃度孵育12～16 h; 室溫下緩沖液液洗3次,加辣根過氧化物酶標記的驢抗兔IgG (Amersham) 1 h; 室溫下緩沖液液洗3次,增強發光 (ECL, Amersham) 和曝光。 Bax、Caspase-3、自噬相關蛋白(LC3-Ⅱ)的免疫印跡步驟與Bcl-2類似。以對照組為標準 (100%) 測定條帶的光密度，用β-actin校正。

2 結 果

2.1建立慢性CsA腎毒性 與對照組(307±3.0)相比，慢性CsA毒性組大鼠(264±4.6)表現為體重下降、血CsA濃度增高(0±0 vs 2 670±317.9)、腎功能低下(血肌酐：38.5±3.9 vs 78.5±14.8，賧酸氮12.5±0.8 vs 27.9±38)，表明成功建立了慢性CsA腎毒性的大鼠模型。

2.2CsA對腎臟病理的影響 與對照組(圖1A、圖1C)相比，CsA毒性組(圖1B、圖1D)表現為明顯的帶狀纖維化形成〔(43±9)% vs (0±0)%,P<0.01〕。

圖1 兩組間腎小管間質纖維化程度和細胞凋亡數

2.3CsA誘導細胞凋亡 TUNEL染色示CsA毒性組大鼠腎小管上皮細胞TUNEL陽性細胞數明顯增加(38±6.5 vs 8±3.7,P<0.01)。在分子水平上，CsA致凋亡基因Bax〔(145±17)% vs (100±7)%,P<0.01〕和活化Caspase-3〔(136±13)% vs (100±5)%,P<0.01〕蛋白的表達上調，而抗凋亡基因Bcl2〔(67±9)% vs (100±6)%,P<0.01〕蛋白的表達顯著下調，使Bcl-2/Bax比率減少〔(46±19)% vs (100±6)%,P<0.01〕。

2.4CsA誘導細胞自噬 CsA腎毒性組腎中LC3-Ⅱ蛋白的表達明顯增加〔(148±12)% vs (100±11)%,P<0.01〕。

2.5CsA誘導氧化應激損傷 與對照組相比，CsA毒性組血〔(223±15)% vs (116±6),P<0.01〕 和尿〔(138±12)% vs (71±7)%,P<0.01〕 氧化應激標志物8-OHdG的水平顯著升高。

2.6相關關系 Pearson直線相關分析表明，腎小管間質纖維化程度與TUNEL陽性細胞數和LC3-Ⅱ蛋白表達呈正相關(r=0.759,0.729,均P=0.001)。

3 討 論

盡管新的免疫抑制劑不斷問世，鈣調素抑制劑環孢素A(CsA)和他克莫司(FK506)仍為第一線強有力的免疫抑制劑，廣泛應用于腎移植、難治性腎病綜合征、各種繼發性腎小球腎炎、促紅素抗體誘導的純紅細胞再生障礙性貧血。因此，揭示慢性CsA腎毒性的發病和防治機制顯得尤為重要。本實驗利用慢性CsA腎毒性大鼠模型，觀察細胞凋亡和細胞自噬是否參與 CsA誘導的腎小管間質纖維化。結果表明，細胞凋亡和細胞自噬是慢性CsA腎毒性的重要發病機制之一。

細胞凋亡在生物體的進化、內環境的穩定以及多個系統器官的發育中起著重要作用。正常生理情況下，細胞凋亡可以清除老化細胞對機體是有益的。然而在病理狀態下，細胞凋亡參與多種疾病的發生、發展。研究〔4～7〕表明，細胞凋亡參與了5/6腎切除模型〔5〕、單側輸尿管結扎模型〔4〕、缺血再灌注損傷〔6〕、糖尿病腎病〔7〕等各種腎臟疾病的發病過程。Ortiz等〔8〕報道CsA可直接誘導小鼠腎近曲小管上皮細胞株(MCT)細胞凋亡，呈劑量和時間依賴性。另外，CsA還可通過各種因子如血管緊張素Ⅱ、轉化生長因子β1、表皮生長因子等間接地引起腎實質細胞凋亡〔9〕。以往報道過CsA可調控凋亡基因Caspase家族成員和Bcl-2/Bax系統，從而誘導腎小管上皮細胞凋亡，而且細胞凋亡與TIF呈正相關，表明細胞凋亡是引起TIF的發病機制之一〔10〕?；谝陨侠碚?，本研究檢測了細胞凋亡相關基因，結果表明慢性CsA腎毒性大鼠TUNEL陽性細胞數顯著增加，伴隨Bcl-2/Bax蛋白表達的比率減少和Caspase-3表達上調，而且TUNEL陽性細胞數和TIF程度呈正相關。因此，推測CsA調控Bcl-2/Bax和Caspase-3導致腎小管上皮細胞凋亡，參與了慢性CsA腎毒性的TIF。

細胞自噬是真核細胞內物質進行周轉、維持內環境穩定的重要過程，該過程中一些損壞的蛋白或細胞器被雙層膜結構的自噬小泡包裹后，送入溶酶體中進行降解。在新陳代謝、基因毒性、缺血、缺氧等條件下，細胞自噬可作為保護性機制。然而，過度的細胞自噬將導致大量的腎實質細胞死亡從而參與腎損傷過程〔4,11〕。細胞自噬主要有三種形式，即微自噬、巨自噬和分子伴侶介導的自噬。利用電子顯微鏡和免疫印跡等方法檢測細胞自噬。為揭示是否細胞自噬與CsA所致腎臟損傷有關，本實驗利用免疫印跡法檢測自噬體LC3-Ⅱ蛋白的表達。本研究結果與以往報道相一致，表明在慢性CsA腎臟損傷中，細胞自噬作為重要的發病機制參與了慢性CsA腎毒性的TIF。

氧化應激誘導是腎小管上皮細胞凋亡和細胞自噬參與各種腎臟損傷的過程〔12〕。在慢性CsA腎毒性諸多發病因素中，氧化應激扮演著至關重要的作用。CsA可以直接導致腎入球動脈狹窄引起缺血、缺氧損傷，其結果是產生活性氧自由基和減少抗氧化酶如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶從而誘導氧化應激損傷，而后者反過來引起腎小管細胞凋亡〔13〕。最近報道CsA誘導的氧化應激與細胞自噬緊密相關，因此抗氧化劑如左卡尼汀〔2〕或N-乙酰半胱氨酸〔13〕可明顯減少細胞凋亡和細胞自噬。本研究結果表明，長期CsA治療可導致氧化應激損傷，氧化應激誘發腎小管上皮細胞凋亡和細胞自噬，是慢性CsA腎毒性TIF的重要原因之一。

綜上, 細胞凋亡和細胞自噬參與了慢性CsA腎毒性的發??；氧化應激是導致細胞凋亡和細胞自噬的重要因素。本研究結果為臨床上進一步認識慢性CsA腎毒性的發病機制提供了分子理論基礎。

4 參考文獻

1Lei DM, Piao SG, Jin YS,etal. Expression of erythropoietin and its receptor in kidneys from normal and cyclosporine-treated rats〔J〕. Transplant Proc,2014;46(2): 521-8.

2Xiang Y, Piao SG, Zou HB,etal. L-carnitine protects against cyclosporine-induced pancreatic and renal injury in rats〔J〕. Transplant Proc,2013;45(8): 3127-34.

3Yamahara K, Yasuda M, Kume S,etal. The role of autophagy in the pathogenesis of diabetic nephropathy〔J〕. J Diabetes Res,2013; 2013:193757.

4Xu Y, Ruan S, Wu X,etal. Autophagy and apoptosis in tubular cells following unilateral ureteral obstruction are associated with mitochondrial oxidative stress〔J〕. Int J Mol Med,2013;31(3): 628-36.

5朱鐵錘. 淫羊藿苷對 5/6 腎切除大鼠 Bcl-2, Bax 表達的影響〔J〕. 中國老年學雜志, 2013;33(17): 4206-7.

6Wu H, Steenstra R, de Boer EC,etal. Preconditioning with recombinant high-mobility group box 1 protein protects the kidney against ischemia-reperfusion injury in mice〔J〕. Kidney Int,2014;85(4): 824-32.

7劉長山, 王秀軍，柳 林,等. 糖尿病大鼠組織非酶糖化、細胞凋亡與糖尿病腎病的關系〔J〕. 中國老年學雜志, 2011;31(16): 3110-2.

8Ortiz A, Lorz C, Catalán M,etal. Cyclosporine A induces apoptosis in murine tubular epithelial cells: role of caspases〔J〕. Kidney Int Suppl， 1998；68: S25-9.

9Li C, Lim SW, Sun BK,etal. Expression of apoptosis-related factors in chronic cyclosporine nephrotoxicity after cyclosporine withdrawal〔J〕. Acta Pharmacol Sin,2004;25(4): 401-11.

10Lee SH, Li C, Lim SW,etal. Attenuation of interstitial inflammation and fibrosis by recombinant human erythropoietin in chronic cyclosporine nephropathy〔J〕. Am J Nephrol,2005;25(1): 64-76.

11Kitada M, Takeda A, Nagai T,etal. Dietary restriction ameliorates diabetic nephropathy through anti-inflammatory effects and regulation of the autophagy via restoration of Sirt1 in diabetic Wistar fatty (fa/fa) rats: a model of type 2 diabetes〔J〕. Exp Diabetes Res,2011;2011: 908185.

12Lim SW, Hyoung BJ, Piao SG,etal. Chronic cyclosporine nephropathy is characterized by excessive autophagosome formation and decreased autophagic clearance〔J〕. Transplantation,2012;94(3): 218-25.

13Piao SG, Kang SH, Lim SW,etal. Influence of N-acetylcysteine on Klotho expression and its signaling pathway in experimental model of chronic cyclosporine nephropathy in mice〔J〕. Transplantation,2013;96(2): 146-53.