血必凈對內毒素血癥大鼠炎癥反應的保護作用及心肌AngⅡ和Toll受體-4表達的影響

王葉舟

(福建醫科大學附屬第一醫院干部病房，福建 福州 350003)

內毒素血癥(ETM)是一種臨床常見的危重急癥，主要病因為細菌釋放大量內毒素進入血液，不僅可繼發器官損傷，嚴重者可導致休克甚至死亡〔1〕。內毒素在ETM發病中僅起觸發作用，而由內毒素引發的炎癥反應至關重要，多種炎癥因子參與了ETM的發病過程，因此控制炎癥反應是緩解ETM的根本措施〔2,3〕。心臟是ETM的主要受累器官，機體釋放的一系列炎癥因子，可影響腎素-血管緊張素系統，導致循環障礙，加重了細胞缺血、缺氧〔4，5〕。Toll樣受體4(TLR-4)介導炎癥反應，在ETM大鼠心肌細胞中表達升高〔6〕。血必凈(XBJ)是一種中藥材提取物，具有活血化瘀、疏通經絡、潰散毒邪的作用，可拮抗內毒素并抑制炎癥反應〔7〕，故推測XBJ也可用于ETM治療。本研究觀察XBJ對ETM炎癥反應的改善作用，同時分析其對心肌血管緊張素(Ang)Ⅱ和TLR-4水平的影響。

1 材料與方法

1.1試劑與主要儀器 脂多糖(LPS)、Triton X100，美國Sigma公司；兔抗鼠β-actin、TLR-4一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗，美國Santa Cruz公司；BCA蛋白分析試劑盒，碧云天生物科技公司；血漿腫瘤壞死因子(TNF)-α、C-反應蛋白(CRP)和白介素(IL)-6，南京建成生物工程研究所；AngⅡ試劑盒，中國北方生物技術研究所；TLR-4、β-actin引物由寶生物工程(大連)有限公司合成；XBJ注射液(10 ml/支)，天津紅日藥業。

1.2動物與分組 選取8周齡的雄性SD大鼠30只并采用陰莖背靜脈注射8 mg/kg LPS誘導ETM大鼠模型，根據實驗設計分3組(n=10)：LPS組，LPS+ XBJ組和LPS+地塞米松(DEX)組。LPS+XBJ組和LPS+DEX組在注射LPS的同時分別給予XBJ 5 ml/kg和DEX 5 mg/kg。選取同批次的10只正常大鼠作對照(對照組)，僅給予等體積生理鹽水。所有大鼠在實驗前均飼養于相同環境下(安靜、濕度60%～70%且12 h/12 h明暗周期)，可自由獲取飲水、飲食。實驗前均至少喂養1 w，待大鼠狀態穩定后進行相應實驗。

1.3血漿炎癥因子及心肌AngⅡ檢測 3 h后從右側頸總動脈采血置于抗凝管中，4℃ 5 000 r/min離心5 min，保留上清，同時靜脈注射1 ml KCl使大鼠心臟停在舒張期，迅速取出心臟，采用中性PBS(pH7.4)漂洗，濾紙吸干后修剪心臟，保留左心室并將其剪碎，充分勻漿后12 000 r/min離心10 min，保留上清，樣本均于低溫冰箱中保存備用。采用酶聯免疫吸附法檢測各組血漿TNF-α、CRP和IL-6水平，放射免疫法檢測心肌組織中AngⅡ水平。以上操作均嚴格遵守試劑盒說明書。

1.4Western印跡法 采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白法檢測心肌組織上清液TLR-4蛋白濃度，加入上樣緩沖液充分混勻，煮沸10 min后每孔加入30 μg蛋白，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并采用半干轉法轉移至醋酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉后，根據膜面積加入TLR-4(1∶200)的一抗，4℃孵育過夜，次日加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，選擇β-actin為內參(1∶3 000)，每步間采用TBST沖洗。采用ECL化學發光法顯影，采用 Image Pro Plus軟件分析目的條帶的光密度。

1.5RT-PCR法 采用RNA提取試劑盒提取心肌細胞的總RNA，干燥RNA沉淀并保存于適量DEPC水中，-80℃保存備用，檢測260、280 nm波長下的吸光度(A)并計算A260/A280，同時采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。PCR總反應體系為25 μl，包含2 μl引物(20 μmol/L)、2.5 μl dNTP混合液、0.5 μl AMV-Optimized Taq酶、5 μl MgCl2(25 mmol/L)及4 μg總RNA。TLR-4引物：5′-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3′(正義)，5′-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3′(反義)；內參β-actin：5′-TCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3′(正義)，5′-TAGAGCCACCAATCCACACA-3′(反義)。反應條件：逆轉錄反應50℃、30 min，94℃、2 min滅活逆轉錄酶酶；94℃、30 s(變性)，57℃、30 s(變性)，72℃、30 s(延伸)，共30個循環，72℃最終延伸5 min。反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，采用Bio-Rad凝膠成像系統分析，TLR-4 mRNA表達量以其與內參的比值表示。

2 結 果

2.1血必凈對ETM大鼠血漿炎癥因子水平的影響 LPS組、LPS+XBJ組和LPS+DEX組的血漿炎癥因子水平均高于對照組(P<0.05)，LPS+XBJ組的TNF-α和IL-6水平均低于LPS組(P<0.05)，與LPS+DEX組的差異均無統計學意義(P<0.05)，但LPS+XBJ組的CRP與LPS組的差異無統計學意義(P>0.05)，且高于LPS+DEX組(P<0.05)，見表1。

表1 各組血漿炎癥因子水平比較

2.2血必凈對ETM大鼠心肌AngⅡ水平的影響 對照組、LPS組、LPS+XBJ組和LPS+DEX組的心肌AngⅡ水平分別為(68.24±10.28)、(793.85±98.01)、(351.60±75.64)、(149.37±66.82)ng/g，LPS組高于對照組(P<0.05)，XBJ處理可降低LPS誘導的AngⅡ升高(P<0.05)，但與對照組和LPS+DEX組的差異仍有統計學意義(P<0.05)。LPS+DEX組與對照組的差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3血必凈對ETM大鼠心肌TLR-4 mRNA、蛋白水平的影響 LPS組的TLR-4 mRNA、蛋白水平高于對照組(P<0.05)，XBJ處理可降低LPS誘導的TLR-4 mRNA、蛋白水平升高，且與對照組和LPS+DEX組仍有顯著差異(P<0.05)。LPS+DEX組與對照組的差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、表2。

1:對照組;2:LPS組;3:LPS+XBJ組;4:LPS+DEX組

表2 各組心肌TLR-4 mRNA及蛋白表達水平

3 討 論

炎癥反應在ETM發病中發揮關鍵作用，可損傷臟器并影響系統功能，故應及時緩解ETM的炎癥反應〔2〕。XBJ的主要成分為紅花黃色素A，在臨床上對多種細菌感染引起的炎癥反應均有較好的治療效果，如重癥膿毒癥、百草枯中毒及重癥胰腺炎等〔7〕。本研究發現給予ETM大鼠XBJ治療后，可降低其血漿TNF-α、CRP和IL-6水平，表明XBJ對ETM的炎癥反應有保護作用，主要與其具有活血化瘀、潰散毒邪和疏通經絡的功效有關，可拮抗內毒素的作用〔8〕。

腎素-血管緊張素系統激活是ETM的常見病理生理反應，主要與炎癥反應釋放的大量炎癥因子有關。腎素-血管緊張素系統可影響心血管系統功能，導致循環障礙，加重細胞缺血缺氧，導致病情惡化〔9〕。AngⅡ是腎素-血管緊張素系統的重要組成部分，其水平可用于評價該系統的激活狀態〔10〕。本研究發現ETM大鼠的心肌AngⅡ水平升高，提示ETM時心肌的腎素-血管緊張素系統處于激活狀態。XBJ可降低心肌AngⅡ水平，表明XBJ可抑制腎素-血管緊張素系統激活，主要與其降低炎癥反應有關。以上提示XBJ對心肌具有保護作用。

Toll樣受體在ETM的發病過程中起重要作用。心臟是ETM的主要損傷器官，ETM大鼠心肌TLR-4水平升高，提示Toll樣受體被激活，在介導心臟局部炎癥反應中起作用〔6〕。本研究發現XBJ可降低心肌TLR-4的蛋白和mRNA水平，進一步表明XBJ對ETM心肌損傷的保護作用。但本研究中經XBJ處理后，血漿炎癥指標及心肌AngⅡ和TLR-4水平仍與正常大鼠有差異，推測主要原因為劑量不足或作用時間較短，這將是后續研究的重點。

4 參考文獻

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