皖北地區Leber遺傳性視神經病一家系線粒體突變位點

劉 輝 王 力 鮑明升 王愛蓮 吳守偉 趙 莉

(蚌埠醫學院生物科學系，安徽 蚌埠 233030)

Leber遺傳性視神經病變(LHON)目前認為是受母親遺傳的一種視神經病，發病多為年輕男性，其臨床癥狀主要表現為急性或亞急性雙眼中心視力下降，通常不伴有眼球疼痛；視野以中心或偏中心暗點居多，通常暗點較大并可向周邊擴展，更易向上方延伸或連接包繞生理盲點；視力大多穩定在0.1以下，雖有全盲者但罕見〔1～4〕。本研究探索皖北地區該病是否有突變位點。

1 病例與方法

1.1病例來源 該病家系來源于皖泗縣地區，經蚌埠醫學院附屬醫院診斷為LHON，患者為15歲女性，其母親為攜帶者，表型正常。舅舅45歲，亦為患者。

1.2基因組DNA提取 在患者及其家屬簽署知情同意書后，對患者抽取靜脈血2～3 ml，并對其家系進行走訪，并抽取其母親和舅舅外周血進行研究。使用全血基因組抽提試劑盒(天根生化科技，北京)提取外周血基因組DNA。為避免外源DNA污染，總DNA提取采用無菌濾紙代替血液樣品作陰性對照，提取方法與其他樣品完全一樣。

1.3引物設計 根據人類線粒體全序列(GenBank登錄號：JQ031816)分別設計ND1基因、ND4基因和ND6基因引物。

設計引物對FP(L3202)和RP(L4424)，擴增產物長度為1 242 bp，涵蓋全部ND1基因956 bp；由于ND4基因較長，設計兩個引物對FP(L10664)和RP(L11489)、FP(L11416)和RP(L12225)，擴增產物長度分別為849 bp和834 bp，拼接后可包含全部ND4基因1 378 bp；設計引物對FP(L14041)和RP(L14837) 擴增產物長度為816 bp，涵蓋全部ND6基因525 bp。見表1。

表1 引物名稱及序列

1.4ND1，ND4和ND6基因擴增及測序 PCR擴增使用Long Taq DNA聚合酶試劑盒(天根生化科技，北京)，擴增線粒體ND1基因、ND4基因和ND6基因；PCR體系為25 μl，含0.5 μg 模板DNA，上、下游引物各0.5 μl(濃度為10 μmol/L)，Long Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μl)0.5 μl，10×Long Taq Buffer 12.5 μl，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2 μl，最后用ddH2O補充體積至25 μl。每個反應包含30循環，循環參數為：94℃變性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，首次循環前95℃預變性5 min，最后一個循環后72℃再延伸10 min。PCR反應在PTC-200 Thermo Cycler (MJ Research公司)上進行。PCR擴增采用無菌濾紙的提取結果替代模板作陰性對照。擴增結果在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并用紫外凝膠成像系統(BioRad公司)拍照分析。擴增得到的ND1基因、ND4基因和ND6基因產物直接送上海Invitrogen公司測序。

1.5BLAST及數據分析 測序結果在NCBI網站進行BLAST比對，以確定所測得序列的正確性。然后用CLUSTAL X軟件與正常人對應位點的DNA片段進行比對，以尋找是否有新的突變位點，并用MEGA 2.0軟件對所測DNA序列進行蛋白質的氨基酸序列進行預測，并探索突變位點是否會引起氨基酸殘基的改變。

2 結 果

2.1突變位點分析 發現2個新的突變位點，且具有家系遺傳特點：第一個突變位點，位于ND4基因內線粒體全序列第11 196位，由T突變為C(圖1，圖2)；第二個突變位點，位于ND4基因內線粒體全序列第11 770位，由G突變為A(圖3，圖4)。

2.2突變位點對應預測氨基酸的分析 所測線粒體DNA序列用MEGA2.0軟件預測氨基酸序列，密碼子表選用verteabrate mitochondria，來判斷所測線粒體DNA序列中所發生的變異位點是否會造成氨基酸序列的改變，從而探討與LHON的關系。發現ND1，ND4和ND6基因中，兩個變異位點所對應的氨基酸位點均發生了改變。在ND4基因中，對應的氨基酸由苯丙氨酸(F)變為亮氨酸(L)；精氨酸(R)變為組氨酸(H)(圖5)這兩個變異的位點在這個家族的三個成員中均出現，但是否由于這兩個變異位點引起的疾病尚不能下結論，還需深入研究。

方框內示突變位點；ND4、DN4 NPH2和DN4 NP183：正常人線粒體序列，1-ND4和3-ND4為該家系中患者線粒體序列，2-DN4，為該家系中攜帶者線粒體序列；*正常位點

圖2 該家系線粒體ND4基因中第一個突變位點處測序圖譜(無亂峰，信號可信)

方框內示突變位點；ND42、DN42 NP183和DN42 NPH2：正常人線粒體序列，1-ND42和3-ND42為該家系中患者線粒體序列，2-DN42，為該家系中攜帶者線粒體序列；*正常位點

圖4 該家系線粒體ND4基因中第2個突變位點處測序圖譜(無亂峰，信號可信)

圖5 突變位點對應氨基酸變化

3 討 論

LHON是一種比較少見的遺傳性視神經病，有明顯家族史，但遺傳方式頗為特殊，與孟德爾定律不符，多數患者為男性，僅通過女性傳遞。在20世紀80年代以前，對于該疾病的發病原因有多種解釋，直到近年來，各國學者才普遍認為是由于線粒體的某些基因的位點突變引起的。目前的研究發現該病的主要突變位點發生在編碼線粒體呼吸鏈上的NADH脫氫酶(或復合物Ⅰ)的亞基中〔5，6〕，從而導致呼吸鏈上的復合物發生改變而引起LHON的發生。目前已知有3個不同的mtDNA原發性突變，分別發生在線粒體核苷酸序列的3460A/ND1，11778A/ND4和14484C/ND63個位點，這3個原發性突變位點被認為是引起LHON的較強的風險因素〔2，7〕，但是，越來越多的研究發現一些新的線粒體序列點突變對于該病的發生也起到一定至關重要的作用〔8～11〕。

自Wallace等〔5〕首先發現LHON可因線粒體DNA核苷酸位點突變引起以來，越來越多的研究人員發現各種不同的mtDNA點突變與本病有密切關系。ND基因在線粒體的研究中越來越受到重視，本研究發現，皖北地區該家系的患者在常見的3個突變位點3460A/ND1、11778A/ND4和14484C/ND6并未發生點突變，而是有兩個新的突變位點：第一個突變位點，位于ND4基因內線粒體全序列第11 196位，為T11196C；第二個突變位點位于ND4基因內線粒體全序列第11 770位，為G11770A。變異位點對應的氨基酸殘基也隨之發生改變，說明該位點的變異是有意義的，可能是與該疾病的發生有關。目前為止，國內相關研究報道有涉及T14484C 和T14502C〔12〕，G3460A〔13〕，還有ND基因以外其他基因的突變，例如tRNAThr A15951G〔10〕。

本研究發現的新的變異位點只能推測與該疾病的發生有一定的關系，如果要證明某個變異位點與該疾病的發生有因果關系，還需要更多的病例和深入的研究。對于新的變異位點是否是突變，還要排除基因多態性方面的可能，目前還沒有可靠的標準，只能參照已知的多態性位點。通過我們的研究，認為在臨床上檢測，可以通過位點特異性PCR對常見的3個突變位點3460A/ND1、11778A/ND4和14484C/ND6以及T11196C和G11770A進行篩查。

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